[发明专利]一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法

说明书

本发明公开了一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，包括：提取待测水稻植株和对照水稻植株的基因组DNA，加入特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，然后进行HRM分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株与对照植株对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，判定该待测植株编辑成功。本发明方法操作简便快速、有效、结果准确、高通量、使用成本低。利用本发明的方法辅助育种，能大大提高植株筛选效率。

技术领域

本项发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法。

背景技术

在现代生物学研究中，基因组编辑(Genomic editing，GE)技术是人们了解和改良基因功能的重要技术手段。基因组编辑技术的发展先后经历了锌指核酸酶(Zinc fingernucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator likeeffector nucleases，TALENs)技术、和规律成簇间隔短回文重复(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat,CRISPR)/Cas(CRISPR-assoicated)技术。这些人工核酸酶都可以在DNA靶位点产生DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，然后利用生物本身拥有的非同源末端连接或同源重组两种不同的修复机制对DSBs进行修复，实现对基因组的定点编辑。

其中，CRISPR/Cas系统是近两年来刚刚兴起但表现为最有应用前景的一项基因组编辑(Genomic editing，GE)技术，它具有操作简便、效率高等特点，已在拟南芥、烟草、水稻、高粱等植物中成功实现靶向诱变(参见：Nucleic Acids Res,2013,41(20):e188；NatBiotech,2013,31(8):688–691；Nat Biotech,2013,31(8):691–693)。其原理是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶引导到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。利用CRISPR/Cas技术进行基因编辑有特异性、靶向性、可遗传性等优势。

因为植物和动物的细胞构造不同，植物有细胞壁，不能通过显微注射的方法获得基因编辑植株，需要农杆菌介导。以水稻为例，由CRISPR/Cas技术获得基因编辑的植株步骤是：设计两条单链oligo序列，退火形成双链DNA；将双链DNA连接到载体中，转化农杆菌；农杆菌侵染水稻愈伤组织；愈伤组织分化长成待测植株。

CRISPR技术可以在目标区段内引起不同类型的基因突变，多数为1bp插入和小片段缺失以及一个或多个碱基SNP(参见PNAS,2014,111(12):4632-4637)。在利用CRISPR/Cas技术编辑产生的水稻突变群体中，有不同比例的单株出现不同状态的突变，如：嵌合体、杂合型、双等位基因突变、纯合型，不同类型突变植株的情况不同，因此需要采用特定的方法对单株进行鉴别。