[发明专利]一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法

说明书

技术领域

本项发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法。

背景技术

在现代生物学研究中，基因组编辑(Genomicediting，GE)技术是人们了解和改良基因功能的重要技术手段。基因组编辑技术的发展先后经历了锌指核酸酶(Zincfingernucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases，TALENs)技术、和规律成簇间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)/Cas(CRISPR-assoicated)技术。这些人工核酸酶都可以在DNA靶位点产生DNA双链断裂(Doublestrandbreaks，DSBs)，然后利用生物本身拥有的非同源末端连接或同源重组两种不同的修复机制对DSBs进行修复，实现对基因组的定点编辑。

其中，CRISPR/Cas系统是近两年来刚刚兴起但表现为最有应用前景的一项基因组编辑(Genomicediting，GE)技术，它具有操作简便、效率高等特点，已在拟南芥、烟草、水稻、高粱等植物中成功实现靶向诱变(参见：NucleicAcidsRes,2013,41(20):e188；NatBiotech,2013,31(8):688–691；NatBiotech,2013,31(8):691–693)。其原理是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶引导到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。利用CRISPR/Cas技术进行基因编辑有特异性、靶向性、可遗传性等优势。

因为植物和动物的细胞构造不同，植物有细胞壁，不能通过显微注射的方法获得基因编辑植株，需要农杆菌介导。以水稻为例，由CRISPR/Cas技术获得基因编辑的植株步骤是：设计两条单链oligo序列，退火形成双链DNA；将双链DNA连接到载体中，转化农杆菌；农杆菌侵染水稻愈伤组织；愈伤组织分化长成待测植株。

CRISPR技术可以在目标区段内引起不同类型的基因突变，多数为1bp插入和小片段缺失以及一个或多个碱基SNP(参见PNAS,2014,111(12):4632-4637)。在利用CRISPR/Cas技术编辑产生的水稻突变群体中，有不同比例的单株出现不同状态的突变，如：嵌合体、杂合型、双等位基因突变、纯合型，不同类型突变植株的情况不同，因此需要采用特定的方法对单株进行鉴别。

目前，对单株进行鉴别的方法，主要包括有：靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法。克隆测序的方法是将靶序列PCR扩增后，把PCR产物克隆到T载体中然后进行sanger测序，经测序后可以确切知道这条靶序列上的碱基变化。克隆测序法灵敏度高，但是相比之下价格贵，时间长，一般的做法是把筛选出的阳性植株进行测序验证。错配酶法的原理是靶序列经Cas/gRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配，错配酶(主要是T7E1酶)将识别错配的杂合双链并剪切(参见：NatGenet,1995,9:177-183；Nature,2007,449:621-624；CurrOpinStructBiol,2008,18:86-95)。PCR产物经酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，看是否有切割条带，若出现切割条带，则代表该植株被成功编辑。若没有出现切割条带，则代表该植株未被成功编辑。这种方法比克隆测序的方法快速，花费少，但是灵敏度不如克隆测序法，且有假阳性的情况产生。因此，对于CRISPR靶向编辑群体中的突变，目前仍缺乏一种准确率高、成本低廉、快速、高通量的单株鉴别方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法，该方法快速、准确率高、且成本低廉。

一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法，包括：

(1)以未经编辑的作物植株为对照植株，以经靶向基因编辑获得的作物植株为待测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA；

(2)根据与所述靶向基因编辑的靶位点相邻的基因组序列来设计引物，以所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200～500bp；