[发明专利]一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及农作物害虫病原真菌流行病学研究领域，特别涉及一种可表达GFP的生防菌株玫烟色拟青霉FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用。

背景技术

近年来，我国对农业有害生物的生物防治给以了极大的重视。但目前关于生防菌的基础研究比较薄弱，特别是对靶标害虫病原性真菌的流行病研究还缺乏有效合理的技术手段，这严重阻碍了生防菌的利用和发展。

玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)属于半知菌纲，壳霉目、杯霉科。其地理分布广泛,昆虫寄主多样,是蚜虫、粉虱等重要害虫的致病真菌。在自然条件下，可在蔬菜、水果和园林植物等的靶标害虫种群中形成流行病。如在我国南方地区蔬菜植物上的烟粉虱种群中可大面积地持续流行、能有效地控制烟粉虱种群的危害。在国外玫烟色拟青霉已被开发为商品用于防治烟粉虱。然而，关于该生防菌对靶标害虫的侵染和流行病学研究还是空白，最主要的就是无法简便、有效进行害虫病因的鉴别，特别是针对该属中某一特定菌株的流行规律与控制评价，目前还缺乏快捷、可靠的技术进行大规模检测应用。

发明内容

本发明目的是针对目前温室害虫病原真菌流行病学研究中，现有技术无法对靶标害虫致死病因进行有效、快捷、可靠鉴别分析，特别是对生防菌某一特定菌株的流行规律和防控效果评价缺乏可实施的简单方法，提出了一种可表达GFP(绿色荧光蛋白)的FZ01-GFP生防菌株及其应用。

本发明具体的技术方案如下：

本发明提供一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP，该生防菌株为采用原生质体的遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP。

本发明还包括上述生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，具体过程包括：

释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本，通过质粒载体pCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析数据，确定靶标害虫发生规律和生防菌FZ01-GFP流行趋势。

其中，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本的具体步骤为：

每处理固定5点，每点连续调查3株，总计15株番茄，在早晨成虫不大活动时，检查每植株3片叶片的背面，每周固定同一天调查虫口情况，记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本；

优选的，在本发明中，对罹病样本进行PCR分子检测的特异引物如SEQIDNO.1-2所示：

SEQIDNO.1：5′-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3′；

SEQIDNO.2：5′-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3′。

本发明中，PCR分子检测鉴别的具体步骤包括：

(1)单头样品DNA提取；

(2)PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl10×PCR反应缓冲液，各0.5μl10μmol/L所述引物，和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min；

(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的有无和片段大小判定结果，进一步鉴定致死病因。

具体地，鉴定致死病因的标准为：特异性地扩增出417bp条带时，判断靶标害虫病因为FZ01-GFP生防菌株侵染致死，无417bp条带则判断为非FZ01-GFP生防菌侵染。

本发明的关键性技术是采用原生质体遗传转化方法，将表达载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得了一株可表达绿色荧光蛋白的菌株(FZ01-GFP)。在温室内通过特定时间进行菌株释放，经科学的采样方法，并以质粒特异引物对罹病样本病因是否由FZ01-GFP菌株侵染所致可进行大规模的PCR分子检测鉴别，结果快捷、可靠。本发明以2014年室内玫烟色拟青霉菌FZ01-GFP侵染试验所采集的烟粉虱50份罹病样本为供试材料，对害虫病因是否为FZ01-GFP菌株侵染引起进行分析，按上述PCR体系和鉴定方法，结果都能特异性地扩增出417bp目的条带，证实该方法可用于玫烟色拟青霉流行病学研究中快速可靠的检测和鉴定。