[发明专利]一种烟曲霉生物膜流动模型

权利要求书

1.一种烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成；

（1）制备烟曲霉孢子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，35-37℃下活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集孢子，用MOPS缓冲后调pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基重悬孢子，光学显微镜下用血细胞板计数悬液中的孢子量，用上述RPMI-1640液体培养基将计数好的孢子悬液稀释，调整孢子终浓度为1-3×10⁵孢子/ml；

（2）建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动泵，进液储液瓶，硅橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber，废液收集瓶；将连接好的流动装置至于35-37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态；

（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

2.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（2）建立生物膜流动模型：将所述的流动装置的置于35-37.0℃恒温生化培养箱中，流动装置进液端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸钠的储液瓶中，出液端硅橡胶管开口置入废液收集瓶中，启动蠕动泵，调节泵速为1.5-2.0rpm，持续4-5h泵入0.5%次氯酸钠消毒于整个流动装置；随后将进液端硅橡胶管入口置入含1.5-2L灭菌双蒸水的烧瓶中，以30-50rpm泵速高速流通无菌双蒸水3-4h清洗流动装置，同时开启恒温培养箱内的紫外射线消毒灯消毒整个装置外表面及其恒温培养箱内部，直至灭菌清洗完毕；

将流动装置进液端管硅橡胶管开口置入经MOPS缓冲后pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基的储液瓶中，培养液温度为35-37℃，调节蠕动泵泵速为3-5rpm，持续泵入5-10min，使RPMI-1640液体培养基充满整个装置管道；暂时停止蠕动泵，于距chamber上游2-2.5cm处夹闭止水夹，用75%酒精消毒该段硅橡胶管，用1mL灭菌注射器将步骤（1）中配制备好的浓度为1-3×10⁵孢子/ml的孢子悬液以300μL/channel的接种量，从该段管道注入chamber，进液完毕后退出注射针头，将chambe下游的硅橡胶管用止水夹夹闭，将chamber倒置使其观察面朝下，静置2-4小时使孢子沉降并粘附于各chamber内各channel的观察面；孢子粘附完成后，将chamber转置使各channel的观察面朝上，再次开启蠕动泵，调节泵速为1.75rpm，菌体表面流速为0.2mm/s；于37.0℃恒温培养8h、16h、24h、48h、72h后，停止蠕动泵，对上述各个时点各个channel观察面上形成的烟曲霉生物膜进行胞外基质染色，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜的形态。

3.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的流动装置还可以用75%乙醇进行消毒，消毒后，用转速为50-100rmp的无菌双蒸水清洗。

4.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（2）孢子悬液在chamber倒置2小时后开通。

5.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，所述的步骤（2）泵流速为1.75rpm，菌体表面流速为0.2mm/s。