[发明专利]一种烟曲霉生物膜流动模型

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种烟曲霉生物膜流动模型及流动装置。

背景技术

烟曲霉是一种常见的条件致病性真菌，其孢子体积微小，直径2～3μm，漂浮于空气中，经呼吸道进入人体，肺部是曲霉感染主要发生部位。当宿主免疫力低下或者肺部的防御机制下降时，可引起过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）、曲霉瘤或侵袭性曲霉病（IA）。而烟曲霉感染中90％为侵袭性感染，临床表现缺乏特异性，死亡率高。近年的研究表明烟曲霉菌可分泌大量胞外基质，在感染病灶中形成生物被膜，加重真菌的耐药性。烟曲霉感染已经受到众多临床工作者和科研者的关注。目前国外关于曲霉流动和静止模型下生物被膜成膜能力仍存在争议，曲霉的研究模型尚无定论。而国内研究人员大多研究的是静止模型的生物膜形态及结构，相关的药物干预亦是针对静止模型状态的生物膜形态和结构的研究，但静止模型的生物膜形态和生物体内的生物膜形态是存在差异的，生物体内由于血液的流动以及其他因素的影响，因此在静止模型下研究出的药物，具体实施到生物体内，却达不到预期的效果。这已成为了限制烟曲霉生物膜及其相关的药物干预研究的一大难题。

发明内容

本发明的目的是解决现有大多研究静止模型的烟曲霉生物结构及形态，提供一种更加接近于生命体内烟曲霉生物膜的形态和结构的研究模型，提供一种烟曲霉生物流动模型。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种烟曲霉生物膜流动模型，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成；

（1）制备烟曲霉孢子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，35-37℃下活化3-5天，用含0.025%Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集孢子，用MOPS缓冲后调pH值为6.9-7.1的RPMI-1640液体培养基重悬孢子，光学显微镜下用血细胞板计数悬液中的孢子量，用上述RPMI-1640液体培养基将计数好的孢子悬液稀释，调整孢子终浓度为1-3×10⁵孢子/ml；

（2）建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动泵，进液储液瓶，硅橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber，废液收集瓶；蠕动泵与进液储液瓶通过硅橡胶管连接，与进液储液瓶的硅橡胶管即进液端，蠕动泵与单向排气装置通过硅橡胶管连接，单向排气装置和chamber通过硅橡胶管连接，距chamber两端2-4cm处的硅橡胶管上各设置一个止水夹，chamber和废液收集瓶通过硅橡胶管，将连接好的流动装置至于35-37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态；

（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC-ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515-530nm。

优选地，将所述的流动装置的置于35-37.0℃恒温生化培养箱中，流动装置进液端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸钠的储液瓶中，出液端硅橡胶管开口置入废液收集瓶中，启动蠕动泵，调节泵速为1.5-2.0rpm，持续4-5h泵入0.5%次氯酸钠消毒于整个流动装置；随后将进液端硅橡胶管入口置入含1.5-2L灭菌双蒸水的烧瓶中，以30-50rpm泵速高速流通无菌双蒸水3-4h清洗流动装置，同时开启恒温培养箱内的紫外射线消毒灯消毒整个装置外表面及其恒温培养箱内部，直至灭菌清洗完毕；