[发明专利]一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，试剂盒内设有预包被HIV-1P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMBA液和显色剂TMBB液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含P24抗体的人血清；HIV-1P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列SEQIDNO:1构成。

2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的HIV-1P24抗原的制备方法是：选择HIV-1阳性样本，提取RNA反转录为cDNA；分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：

gag_A_SEQIDNO:2，gag_S_SEQIDNO:3；第二轮引物为：P24_S1：SEQIDNO:4，P24_A1：SEQIDNO:5；第三轮引物为：P24_NCOⅠ-2：SEQIDNO:6，其5’端设计有NCOⅠ酶切位点；P24_XHOⅠ-2：SEQIDNO:7，其5’端设计有XHOⅠ酶切位点；

利用上述引物，扩增模板cDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCOⅠ和XHOⅠ分别双酶切，酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白。

3.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的预包被HIV-1P24抗原酶标板的制备方法是：

（1）将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔100ul稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4℃，16-18小时；

（2）微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

（3）封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置于37℃水浴箱，2h；

（4）微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

（5）预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用。

4.根据权利要求1或2或3所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，其检测方法是：

所述的检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒的检测方法：

（1）实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-1P24抗原酶标板的微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；

（2）试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；

（3）加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1：20稀释，每个待测样本的微孔中待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样；

（4）温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；

（5）洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

（6）加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul；

（7）温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；

（8）洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

（9）加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入显色剂TMBA液和显色剂TMBB液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37℃水浴箱，温育15min；

（10）加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入50ul终止液，震荡仪震荡混匀；

（11）检测：取波长450nm设定酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；

（12）结果判断：阴性对照A值*2.5＝临界值，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳性，反之，则为阳性。