[发明专利]一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)是艾滋病的病原体能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。由于其基因易突变，到目前为止还未有特效的防治疫苗，所以防治艾滋病仍是以早发现缩小隐形感染传播范围，早治疗防止病情进一步恶化。虽然自1983发现HIV病毒以来，HIV病毒相关检测指标的研究一直没有停息过，研究从HIV抗体检测到p24抗原检测、HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数等检测项目。但目前在国内的初筛实验依然以HIV抗体检测为主，窗口期较长容易漏检。目前HIV分为1型和2型，但是国内主要流行HIV-1，而在HIV-1病毒中，gag基因所编码的结构蛋白是该病毒含量最丰富的蛋白，对于HIV-1颗粒的组装及释放至关重要且相对稳定不易突变。gag基因全长表达产物P55经蛋白酶水解后成为P24/P17/P15蛋白，而p24是HIV-1病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV-1各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-1P24抗体出现较其他抗体早，所以可用于HIV-1感染的早期辅助诊断，但目前的HIV-1P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低，至今未能得到广泛应用。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，可有效解决现有ELISA检测HIV-1抗体的方法检测窗口期长，易漏检及HIV-1P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题。

本发明解决的技术方案是，该试剂盒内设有预包被HIV-1P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体(即酶标二抗，购买于生工生物工程有限公司)、抗体稀释液、显色剂TMBA液和显色剂TMBB液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含HIV-1P24抗体的人血清；HIV-1P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列构成：

所述的HIV-1P24抗原的制备方法是：选择HIV-1阳性样本，提取RNA反转录为cDNA；分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：

gag_A_5’-TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3’

gag_S_5’-CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3’

第二轮引物为：

P24_S1：5’-AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3’

P24_A1：5’-TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3’

第三轮引物为：

P24_NCOⅠ-2：5’-TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT-3’，其5’端设计有NCOⅠ酶切位点；

P24_XHOⅠ-2：5’-AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT-3’，其5’端设计有XHOⅠ酶切位点；

利用上述引物，扩增模板cDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段(P24DNA)，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCOⅠ和XHOⅠ分别双酶切，酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白；

所述的预包被HIV-1P24抗原酶标板的制备方法是：