[发明专利]粪便样本保存液及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及粪便样本保存液及其制备方法和应用。

背景技术

粪便、毛发、唾液、尿液等非损伤性样本广泛运用于法医学、野生动物研究、临床研究，其中粪便样本是临床检验的有效手段和普查最常用的，具有简便易行、成本低廉、无创、适合大规模人群筛查的特点。随着分子生物学的发展，肿瘤的发生发展归因于相关基因突变，而粪便中的脱落细胞包含着与大肠癌关系密切的突变基因，粪便中基因检测可望成为筛选诊断胃肠道肿瘤的早期筛查的新方法。据报道，一家美国公司开发了粪便DNA(Stool-basedDNA，sDNA)筛选试验，用于检测和结肠癌相关的DNA标志物。10000例临床试验数据显示在结肠癌检测的灵敏度上来看是92％，检测癌前息肉的灵敏度为42％，超过2厘米大的息肉的检测灵敏度是66％，所有临床数据的特异性为87％。

此外，粪便中存在大量微生物菌落，肠道菌群组成是与宿主长期共同进化的结果，并且同宿主的健康和疾病如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等密切相关，粪便中肠道总基因组(肠道宏基因组学)研究已成为当今的热点研究领域。

但是，粪便成分十分复杂，含有大量的消化残余及细菌产生的各种核酸降解酶如蛋白酶、DNA酶(DNases)和RNA酶(RNases)、各种PCR抑制剂(如胆盐、胆红素、腐殖质和色素)，使得粪便样本中的细胞及核酸极易受到破坏和降解。而目前的粪便样本保存方法，可保存时间短，样本再度利用合格率低，保存条件苛刻，成本高。

因而，目前的粪便样本液及保存方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种保存时间长、样本再度利用合格率高、保存方便的粪便样本保存手段。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

迄今，国内外研究者发展了多种粪便保存的方法，原理包括：1)低温降低各种降解酶的活性，低温处理即冷冻法，一般保存于-20℃下；2)脱水干燥抑制各种生化反应有硅胶干燥、二氧化硅干燥、微波干燥等；3)保存液常用的有无水乙醇、70％乙醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲亚砜饱和盐溶液(DETs)等抑制降解酶和微生物活性。这些保存方法成分简单，作用单一，随着时间延长保存效果不明显。

发明人在长期粪便样本基因研究中尝试过各种保存方法包括以上常见的方法，效果都不 理想，低温保存使得异地搜集样本受限制，样本运输成本大大增加，有些经过优化如(保存液运输、保存液加低温长期保存)短期效果还可以，但是样本放置1-3个月就发现仍有明显降解，DNA量不足给课题研究带来很大困扰，也促使发明人进行了多种实验探索，以期提供一种常温、简单、低廉且长效的粪便样本保存方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种粪便样本保存液。根据本发明的实施例，该粪便样本保存液包含：45体积％-60体积％的固定剂；0.1质量％-15质量％的固定剂辅助剂；0.01质量％-1.5质量％的抗凝剂；10体积％-15体积％的缓冲液；0.01质量％-1质量％的离子强度维持剂；0.01体积％-0.5体积％的非离子去污剂；以及余量为水，其中，所述固定剂为选自甲醇、乙醇、乙二醇和异丙醇的至少一种，所述固定辅助剂为选自醋酸和醋酸盐的至少一种，所述抗凝剂为选自乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐的至少一种，所述缓冲液为选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、ACES缓冲液、ADA缓冲液、BIS-TRIS缓冲液、MES缓冲液和PIPES缓冲液的至少一种，所述离子强度维持剂为氯化盐，所述非离子去污剂为选自吐温20、NP-40和TritonX-100的至少一种。

发明人惊奇地发现，利用本发明的粪便样本保存液能有效抑制粪便样本中DNA降解及细胞受损，维持细胞形态，保证样本质量，从而使得保存的粪便样本中核酸和细胞可达到进一步研究的需要。此外，根据本发明的实施例，本发明的粪便样本保存液制备容易，成本低，常温下即可保存粪便样本，且对样本保存时间长，保存后样本再度利用合格率高。

另外，根据本发明上述实施例的粪便样本保存液还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述缓冲液的pH值为7.4-8.0。由此，能够有效维持粪便样本pH稳定，维持细胞形态。

根据本发明的一些实施例，所述粪便样本保存液的pH值为7.4-8.0。由此，用于保存粪便样本时，样本中DNA不易降解断裂。

根据本发明的一些具体示例，所述离子强度维持剂为选自氯化钠和氯化钾的至少一种。