[发明专利]中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域中SNP分型检测领域，具体涉及一种中国人群肥胖易感基因SNP分型试剂盒及其使用方法。

背景技术

肥胖是一种常见的营养代谢性疾病。2002年WHO将肥胖列为造成人类疾病负担的全球一级风险因素之一，预防肥胖症的流行也是21世纪前50年世界各国面临的最大公共卫生挑战之一。家系分析和双生子研究表明遗传因素在肥胖发生中起着非常重要的作用，有研究显示父母双方有一方肥胖者，其子女发生肥胖的概率为41-50%，而父母双方均肥胖者，其子女发生肥胖的概率增为66-80%。过去有关候选基因的大量研究已经表明，大多数基因与人类脂肪组织中肥胖的发生相关。与人体体质量相关的40%以上的基因变异可以产生遗传差异。随着分子遗传学的进展，人们发现肥胖是多基因遗传病，许多国家都在开展肥胖候选基因研究，到目前为止已经发现600余种基因位点与肥胖症的发生有关，得到广泛证实的与体重调节密切相关的基因主要包括体脂量和肥胖症相关（FTO）基因、瘦素受体（LEPR）基因、载脂蛋白E（APOE）基因、黑皮质素-4受体（MC4R）基因、解偶联蛋白（UCP2）基因、β3-肾上腺素能受体（ADRB3）基因、过氧化物酶增殖活化受体γ（PPARγ2）基因、GNPDA2基因、KCTD15基因、NEGR1基因等。

目前国内常规用于肥胖症基因变异的主要检测方法是限制性片段长度多态性法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP），其原理是当变异影响到某一限制性内切酶的酶切位点时，简单地通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有变异的方法。但是这种方法存在耗时长，操作繁琐，准确度不高等缺点。也有利用PCR结合DNA测序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个位点的应用受到一定限制。因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的肥胖易感基因SNP分型方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。

SNaPshot技术是一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，包括三个基本步骤：扩增、引物延伸和分析。

用单一PCR或多重PCR扩增包括SNP位点在内的区域，然后向最初反应管或板孔中直接加入核酸外切酶（Exonuclease，Exo）消化单链引物，以及虾-碱性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）消化未结合的dNTP底物。去除引物和dNTP，可有效避免其在随后引物反应中的干扰。在ExoSAP酶处理后的PCR产物中加入SNP延伸产物、四种荧光标记的ddNTP混合物以及聚合酶共同完成引物延伸，最后用GeneMapper软件进行等位基因自动化分析。电泳检测的峰高受延伸引物的浓度影响，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色。SNPs作为第三代遗传标记应用于疾病基因的定位、克隆和鉴定，具有快速、简便、高通量的特点。

发明内容

本发明的目的是针对目前中国人群肥胖易感基因SNP位点的特点，选择有密切相关性的12个SNP位点作为筛查目标，弥补目前现有SNP分型筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的肥胖易感基因SNP位点分型试剂盒及其使用方法。

解决上述技术问题的技术方案是：一种中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒，该试剂盒包括以下内容：

（1）PCR反应试剂：包括10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、底物dNTP、FastTaq酶，SNaPshot混合液；

（2）按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物；

（3）按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物；

（4）PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶及其配套的缓冲液；

（5）对照标本：包括单个SNP位点纯合、杂合突变的阳性对照标本、阴性对照标本；