[发明专利]一种牛肌肉增强子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种牛肌肉增强子及其应用。

背景技术

在1978年，Reddy等人首次发现在猿猴病毒基因组中有增强子序列，1981年Banerji等人发现这段序列对于病毒的生存和繁殖是必需的调节序列，有显著的增强基因转录的作用，故称之为“增强子”。

第一个真核增强子是Grosschedl和Birnstiel首次发现的。在真核基因表达调控中，增强子是非常重要的顺式作用元件，与启动子协同作用，对调控真核基因的表达具重要作用。增强子一般由两个以上的增强子元件组成，有增强转录的作用。增强子具有两大作用特点:(l)无方向性，即不管增强子位于启动子上游或下游，均能激活其相应启动子；(2)增强子对启动子的作用，不受两者之间距离的影响。

自1978年以来，已证实在许多生物基因组中都有增强子。由此可以推测增强子是基因调节中的一种普遍现象。增强子在基因活动中的调节作用不仅与调节基因表达的速率有关，同时其作用还具有组织特异性，这揭示了基因调节中的“质和量”的关系。进一步的研究将主要集中在增强子的作用机制，以及怎么能更好的结合增强子作用的特点来应用增强子。

在制备转基因牛构建基因过表达载体时往往需要在载体中加入增强子序列，以提高外源基因在牛中的表达，但是目前所应用的增强子多为小鼠的序列，并没有牛本身的序列，降低了转基因牛的安全性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种牛肌肉增强子及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种牛肌肉增强子，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明还提供了用于扩增所述增强子的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示。

本发明还提供了含有所述增强子的载体。

本发明还提供了含有所述增强子的重组质粒。

本发明还提供了所述重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

1)将权利要求1所述的增强子和pGL3-promoter载体用BamHI和SalI限制性内切酶酶切；

2)电泳后切胶回收酶切产物；

3)将增强子序列和pGL3-promoter载体用T4连接酶连接过夜；

4)将连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后倒置培养；

5)挑取单克隆，在LB培养板中划线，倒置培养，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测进行菌体鉴定；

6)对PCR阳性菌落进行DNA测序；

7)将符合预期的菌落转接到LB培养基中，摇床培养；

8)使用去内毒素质粒DNA制备试剂盒制备得到重组质粒。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

1)将所述的增强子和pGL3-promoter载体(PromegaE1761)用BamHI和SalI限制性内切酶酶切；

2)电泳后切胶回收酶切产物；

3)将增强子序列和pGL3-promoter载体于4℃用T4连接酶(NEBM0202L)连接过夜；

4)将连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后，37℃倒置培养12h；

5)挑取单克隆，在LB培养板中划线，37℃倒置培养8h后，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测进行菌体鉴定；

6)对PCR阳性菌落进行DNA测序；

7)将符合预期的菌落转接到LB培养基中，在37℃摇床220rpm进行培养；

8)使用去内毒素质粒DNA制备试剂盒(OmegaD6950-01)制备得到重组质粒。将制备出的质粒命名为pGL3-1357。

本发明还提供了所述增强子在成肌细胞中增强启动子转录活性方面的应用。

进一步地，所述应用为将前述载体或前述重组质粒转入成肌细胞中。

本发明的有益效果在于：

本发明获得一种新的牛源的肌肉增强子，利用荧光素酶报告系统发现该增强子能在分化的C2C12细胞中显著增强启动子转录活性，为今后制备转基因牛提供了一种新的选择。

附图说明

图1为本发明实施例3所述的分化6天后用Luciferaseassay(PromegaE2920)试剂盒检测萤火虫荧光素酶/海参荧光素酶相对荧光量的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1PCR扩增牛肌肉增强子序列