[发明专利]一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法，属于细胞工程与生物医药技术领域。

背景技术

体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种(非人体)的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断和预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞(LymphokineActivatedKillerCells，LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TumorInfiltrativeLymphocytes，TIL)、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞(IVS)等。国内的免疫细胞治疗较多应用于治疗肿瘤及病毒性感染疾病如肝炎、艾滋病等。目前临床中应用较为成熟的自体免疫细胞治疗技术是肿瘤生物治疗的重要方法之一，是在多种免疫活性因子的作用下，有效活化和扩增从自体外周血中分离的免疫活性细胞(单个核细胞)，回输入患者体内，直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。自体免疫细胞治疗技术包括细胞因子诱导的杀伤细胞(CytokineInducedKillerCells，CIK)免疫治疗、树突状细胞(DendriticCells，DC)免疫治疗、DC-CIK细胞免疫治疗、自然杀伤细胞(NatureKiller，NK)免疫治疗等。

树突状细胞(DendriticCells，DC)是1973年美国Rockeflle大学Steinman和Cohn在观察脾脏细胞时发现的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。DC来源于造血干细胞，广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中，是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，其膜表面高表达MHC-II类分子，能有效刺激初始型T细胞活化，其抗原提呈能力远强于巨噬细胞和B细胞。因此，DC是机体免疫应答的主要启动者，在肿瘤免疫中亦发挥关键作用。国内外学者应用各种方法将DC进行处理，在体外扩增活化，并予以相应的抗原刺激以制成DC疫苗，然后回输至患者体内进行免疫治疗。

然而DC在体内的数量极少，难以满足临床治疗研究的需要，随着研究的深入，体外诱导制备DC的技术取得了很大的进步，目前应用最为广泛的是用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GranulocyteMacrophageColonyStimultingFactor，GM-CSF)和白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)共同刺激单核细胞，使其分化为不成熟DC并进一步分化为成熟DC。也可用GM-CSF和肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)与来源于骨髓或外周血的CD34+造血祖细胞共同培养，获得大量DC。

体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、人AB型血清或自身血清的完全培养基，也可以使用无血清培养基进行无血清培养。血清在细胞培养中的作用主要包括：a.提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供基础培养基所缺乏的营养物质；b.提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而祈祷稳定和调节上述物质活性的作用，此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用；c.提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子；d.提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤；e.提供pH缓冲物质，调节培养基pH；f.影响培养基系统中的某些物理特性如剪切力、粘度、渗透压和气体传递速率等。但是，血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用，如多胺氧化酶能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应形成有细胞毒作用的聚精胺。此外，血清中的补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡。胎牛血清及人异体血清有外来抗原和感染的可能，易引起过敏反应，而且有MHC限制等。而自体血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子和白介素-10是DC分化、成熟的抑制剂，从而导致使用自体血清培养DC产率低。上述使用血清进行DC扩增培养存在的问题大大限制了其在肿瘤免疫治疗中的进一步应用，而相较而言，无血清培养基在基础培养基的基础上，引入成分完全确定或部分明确的血清替代物，使培养基既能满足细胞生长的基本需求，又能有效避免上述因为使用血清带来的诸多不利因素，因此无血清培养基诱导制备DC有着广阔的临床应用前景。