[发明专利]一种新型内切型褐藻胶裂解酶基因及工程菌和应用

权利要求书

1.内切型褐藻胶裂解酶AlgM的基因序列，其特征在于：

(1)、根据从海藻中新分离的菌株Vibriosp.BZM-1，建立该菌的基因组文库，筛选得到褐藻胶裂解酶基因—AlgM；并进行序列测定，该基因的GenBank登录号为KM655840，该基因编码545个氨基酸，核心序列编码521个氨基酸；

(2)、根据核心序列设计引物：在引物的5’端分别加上接头GTCA和GGCCA，引物序列为：

AlgM-F：GTCAATGAAACATAAAATCGTCAAAACATTA

AlgM-R：GGCCATTATTTACCTTGATAGGTGCCGTG；

并通过PCR扩增所述褐藻胶裂解酶基因：扩增条件为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃3min。

2.含有重组褐藻胶裂解酶基因AlgM的表达载体的构建，其特征在于：把重组褐藻胶裂解酶基因AlgM克隆到新型毕赤酵母表达载体pHBM905BDM，首先通过PCR扩增褐藻胶裂解酶基因AlgM序列，在dTTP保护下，用T4DNA聚合酶处理后，然后定向插入到经CpoI和NotI双酶切除去kan抗性基因的载体pHBM905BDM上，获得重组质粒，命名为pHBM905BDM-AlgM。

3.一种利用重组褐藻胶裂解酶制备的工程菌，其特征在于：保藏编号CCTCCNo：M2015500，名称为巴斯德毕赤酵母GS115/AlgM4。

4.利用权利要求3所述的工程菌水解制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：

(1)、发酵褐藻胶裂解酶AlgM：将菌株毕赤酵母GS115/AlgM4置于100mlBMGY培养基中，28℃～30℃，260rpm培养40～50h，至OD₆₀₀为20～30，于室温离心5000rpm，5min，收集菌体；

(2)、将菌体转移至100mlBMMY培养基中，28℃～30℃，260rpm培养，每隔12h补加甲醇；得到上清液即为粗酶液；

(3)、利用得到的粗酶液水解海藻酸钠制备褐藻寡糖：设定水解底物的浓度10％～30％，加入温度为30～40℃的100mlpH在8～9的碱性水做溶剂，一边少量添加底物，逐步递增底物的量达到预定的量，一边少量逐步添加粗酶液1000ul-3000ul，添加底物和酶量比例为1g:100ul，均匀搅拌；保持温度稳定在30～40℃，直至水解浓度达到每100ml含20g海藻酸钠；

(4)、水解完成后，将反应液进行离心去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干燥，得到褐藻寡糖成品。

5.利用权利要求3所述的工程菌水解制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：底物和酶量比例为1g:50-100ul。

6.利用权利要求3所述的工程菌水解制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述底物为褐藻胶、褐藻酸和褐藻酸盐中的一种或者任意比例的两种以上。

7.权利要求3所述的工程菌的制备方法，其特征在于：

(1)、表达重组褐藻胶裂解酶的毕赤酵母工程菌的筛选：将用限制性内切酶SalI线性化的pHBM905BDM-AlgM，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，得到单拷贝数的重组菌株；

(2)、将获得的单拷贝数的重组菌株接种在含有1.0％的海藻酸钠的平板上，从中筛选出水解圈最大的菌株，提取该转化子基因组；

(3)、基于Biobrick方法，将载体pHBM905BDM经过酶切和连接，得到多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒；

(4)、将多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，得到含有可控拷贝数的重组菌株；拷贝数n＝2、3、4……，n为自然数；将四拷贝重组菌株命名为巴斯德毕赤酵母GS115/AlgM4。