[发明专利]一种新型内切型褐藻胶裂解酶基因及工程菌和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型内切型褐藻胶裂解酶AlgM的基因序列。本发明还涉及该重组褐藻胶裂解酶的毕赤酵母基因工程菌的构建以及利用毕赤酵母表达褐藻胶裂解酶的方法。本发明还涉及利用该重组褐藻胶裂解酶水解较高浓度海藻酸钠制备褐藻寡糖的方法。

背景技术

褐藻寡糖是一种最新一代的功能性低聚糖，采用国际领先的分离降解技术得到的聚合度20以下的褐藻低聚糖，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸组成的线型低聚合物。海藻寡糖分子量低，水溶性强，稳定性高，实验和临床已经发现海藻寡糖具有免疫调节、降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗凝血及抗病毒等多种生理活性，还可以作为糖尿病、肥胖症、直肠结肠癌、习惯性便秘患者的疗效食品。在药物研制、功能食品开发、绿色农业等领域具有广阔的开发应用前景。

近年来，关于低聚糖的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入市场，但目前大多数低聚糖产品属于普通型的低聚糖，有效成分不足50％。目前主要采用酸降解法和氧化降解法降解褐藻胶，可以得到聚合度20以下的系列褐藻胶寡糖。而对于酶降解法降解褐藻胶获得褐藻寡糖的研究才刚刚起步，关键是目前获得的褐藻胶裂解酶的活性普遍不高，为了提高产品纯度，必须在后续工艺中使用操作复杂成本过高的提纯工序，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等。酶降解法降解褐藻胶获得褐藻寡糖，关键是褐藻胶裂解酶。如何寻找高活力的褐藻胶裂解酶，使水解的效果提高，使得产品的纯度提高，使后续提纯工序简单有效，能低成本地生产高纯度低聚糖，显得尤为重要。

褐藻胶裂解酶按其降解海藻酸盐部位与片段的不同可分为两大类：专一性裂解1，4糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸的裂解酶(ECA.2.2.3)和专一性裂解1，4糖苷键连接的α-L-古罗糖醛酸的裂解酶(EC4.2.2.11)。它们分别作用于海藻酸盐的甘露糖醛酸段和古罗糖醛酸段，通过β-消去反应裂解褐藻胶的糖苷键，在非还原末端产生C_4，5不饱和双键并在230～240nm有强吸收。褐藻胶裂解酶来源广泛，包括海洋藻类、海洋软体动物，刺皮动物体内和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。国内现在有许多相关科研单位，如中国海洋大学、中国科学院海洋研究所、山东大学微生物研究所、浙江大学舟山海洋研究中心、上海海洋大学等广泛进行了褐藻胶裂解酶及其相关内容的研究，但所报道的发酵酶活性不高，酶解产物纯度低，生产成本高难以工业化。

褐藻胶是褐藻门类藻中提取的一种物质。其主要成分为多聚甘露糖醛酸和多聚古罗糖醛酸所构成的高分子化合物。褐藻胶广泛存在于巨藻、海带、昆布、鹿角菜、墨角藻和马尾藻等上百种褐藻的细胞壁中。在我国人工养殖海带非常普遍，产量也很大，所以在我国人工养殖海带就成了提取褐藻胶的主要原料。褐藻胶的生产加工企业主要集中在山东青岛、烟台和威海，江苏连云港等地。将褐藻胶利用褐藻胶裂解酶经酶法水解制成褐藻寡糖，有很好的市场前景，在一般生产中的一般褐藻胶裂解酶活性差，水解效率低，底物浓度低，不能适应生产的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种重组褐藻胶裂解酶、其工程菌及水解制备褐藻寡糖的方法，运用基因组文库技术从新分离菌株Vibriosp.BZM-1中筛选高效表达的褐藻胶裂解酶基因AlgM，构建重组的褐藻胶裂解酶基因，实现重组褐藻胶裂解酶基因在毕赤酵母中的高效稳定表达，并利用表达的重组褐藻胶裂解酶水解较高浓度海藻酸钠制备褐藻寡糖。

本发明的技术方案如下。

内切型褐藻胶裂解酶AlgM的基因序列，其特征在于：

(1)、根据从海藻中新分离的菌株Vibriosp.BZM-1，建立该菌的基因组文库，筛选得到褐藻胶裂解酶基因—AlgM；并进行序列测定，该基因的GenBank登录号为KM655840，该基因编码545个氨基酸，核心序列编码521个氨基酸；

(2)、根据核心序列设计引物：在引物的5’端分别加上接头GTCA和GGCCA，引物序列为：

AlgM-F：GTCAATGAAACATAAAATCGTCAAAACATTA

AlgM-R：GGCCATTATTTACCTTGATAGGTGCCGTG；

并通过PCR扩增所述褐藻胶裂解酶基因：扩增条件为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃3min。