[发明专利]一种鸡白细胞抗菌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗菌肽的提取方法，具体涉及一种鸡白细胞抗菌肽的制备方法。

背景技术

抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。而且其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具有良好的应用开发前景，抗菌肽的应用可能会带来一场抗微生物战略的新革命。

目前，我国鸡屠宰加工产业迅速发展，年宰鸡超过350亿只，鸡血资源非常丰富，但利用率低，不超过10％，如被加工成血粉作为饲料添加剂，而大多数作为废弃物直接排出，造成了资源浪费和环境污染。有关研究确认，鸡血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从鸡血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。而目前在国内外还未见有从鸡白细胞提取抗菌肽的技术方法和产品。

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种鸡白细胞抗菌肽的制备方法，解决目前国内没有从鸡白细胞中提取抗菌肽的技术方法和产品的问题。

本发明提供的鸡白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：

（1）鸡白细胞的采集：每只鸡腹腔内注入0.5g/L酪蛋白生理盐水200mL,6~8h后,放血处死,收集富含白细胞的腹水,肝素抗凝。经6层纱布过滤除去杂质,2000r/min离心15min,弃上清液,收集白细胞,PBSX液洗涤2次后,用冷却的去离子水裂解残留红细胞,镜检,至无红细胞为止；

（2）萃取：将白细胞中加入10％的醋酸，用料理机进行搅打破碎，60Hz超声波破碎细胞4×60s后染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行破碎，至镜检无完整细胞。4℃、15000r/min离心20min，收集上清液即为异嗜性粒细胞胞浆内的颗粒组份。4℃下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物；

（3）脱酸：将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4℃、15000r/min离心20mi，收集上清液，旋转蒸发除去醋酸和部分水分后，真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在-20℃保存；

（4）抗菌肽的纯化：将冻干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱，同时打开柱的下端出口，收集特征峰洗脱液再真空冷冻干燥得抗菌肽，-20℃保存。

步骤（3）中，旋转蒸发是55℃旋转蒸发30min。

步骤（4）中，层析柱是葡聚糖凝胶SephadexG25。

步骤（4）中，特征峰洗脱液是指在280nm处有吸收峰的洗脱液。

步骤（3）、（4）中，真空冷冻干燥得温度为-50～-60℃，冷冻干燥的时间为24h-48h。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明提供的一种鸡白细胞抗菌肽的提取方法，进行详细的说明。

实施例

参照本实施例的鸡白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤

1）鸡白细胞的采集：选取30只6月龄健康成年鸡，每只鸡腹腔内注入0.5g/L酪蛋白生理盐水200mL,6~8h后,放血处死,收集富含白细胞的腹水,共收集腹水1.5L（获得约7.5×10¹⁰个白细胞,其中约90%以上为异嗜性粒细胞,95%以上为成活细胞），肝素抗凝。经6层纱布过滤除去杂质,2000r/min离心15min,弃上清液,收集白细胞,PBSX液洗涤2次后,用冷却的去离子水裂解残留红细胞,镜检,至无红细胞为止；

2）萃取：将白细胞中加入10％的醋酸，用料理机进行搅打破碎，60Hz超声波破碎细胞4×60s后染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行破碎，至镜检无完整细胞。4℃、15000r/min离心20min，收集上清液即为异嗜性粒细胞胞浆内的颗粒组份。4℃下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物；

3）脱酸：将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4℃下15000r／min离心20min，收集上清液，并于55℃旋转蒸发30min除去醋酸和部分水分后，-60℃真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在一20℃保存。

4）抗菌肽的纯化：将冻干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25，同时打开柱的下端出口，用部分收集器收集洗脱液，将在280nm处有吸收的溶液收集，再真空冷冻干燥得0.31g抗菌肽，-20℃保存。

本发明方法实现了从鸡血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法；采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物；采用本发明方法提取的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能；本发明方法操作方便，所需设备简单，分离提取率高；实施本发明方法的原料鸡血来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。原料鸡血属于屠宰加工的废弃物或副产物，血浆和血球蛋白仍然作为优质蛋白源利用，可制备高蛋白饲料或食用蛋白，本发明方法可使废弃物得到高值化的利用。