[发明专利]一种检测西瓜cDNA样品中是否有基因组DNA污染的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因表达分析技术领域，是一种西瓜基因表达分析时，检测cDNA样品中是否存在基因组DNA污染的方法。

背景技术

基因表达分析已经被广泛地用于基因功能鉴定和转录调控等领域的研究。目前常用的基因表达分析技术有半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR，其中实时荧光定量PCR技术因其快速、准确和所需样品量少等优点，已成为主要的基因表达分析技术。

无论是用半定量RT-PCR还是实时荧光定量PCR进行基因表达分析，在样品制备阶段都是相同的。首先提取样品RNA，反转录成cDNA，再用目标基因的特异性引物进行半定量RT-PCR或者实时荧光定量PCR分析。通常样品中提出的RNA，都会有基因组DNA，所以，在反转录成cDNA前，需要去除基因组DNA。如果基因组DNA去除不净，即cDNA样品中存在基因组DNA的污染，在进行基因表达分析时，尤其是在进行实时荧光定量PCR分析时，基因组DNA和cDNA上的基因目标片段就会被同时扩增，此时，获得的基因表达量与实际的基因表达量会有很大的差异，导致结果错误。因此，在进行基因表达分析前，需要确保cDNA样品中不存在基因组DNA的污染。

目前主要采用酶切的方法在RNA反转录成cDNA之前，降解掉基因组DNA，从而避免基因组DNA的存在对基因表达分析的影响。但尚无方法检测cDNA样品中的基因组DNA是否被完全去除。而且在实际操作中，降解基因组DNA的步骤有可能会被遗漏，或者由于酶活性、反应条件等因素的影响，导致基因组DNA没有被去除干净，以致严重影响随后基因表达分析的准确性。因此，在进行基因表达分析之前，需要一种方法来检测cDNA样品中是否存在基因组DNA的污染。

发明内容

针对基因表达分析时，缺乏有效检测cDNA样品中是否存在基因组DNA污染的方法，为保证基因表达分析的准确性，本发明提供了一种专用于检测cDNA样品中是否存在基因组DNA污染的方法。

本发明解决其技术问题所采用的原理是：基因在表达过程中，先以基因组DNA为模板转录成前体mRNA，再经过编辑、剪切等过程形成成熟的mRNA。大多数基因的前体mRNA都具有内含子结构，在剪切过程中，这些内含子会被剪切掉，相邻的外显子连接在一起，再经过加帽、加尾等过程形成成熟的mRNA。因此，基因的mRNA序列与其在基因组DNA上的序列相比，缺少了内含子序列，比对应的基因组DNA上基因的序列要短。本发明利用基因的mRNA与其对应的基因组DNA序列上的结构差异，在设计基因的特异性引物时，将正向和反向引物分别放在两个相邻的外显子上，当以cDNA和基因组DNA分别为模板进行PCR扩增时，基因组DNA上的扩增产物包含了一个内含子，而cDNA模板上扩增出的产物不包含内含子，所以，以基因组DNA为模板的PCR扩增产物要比以cDNA为模板时的长。因此，本方法通过比较PCR扩增产物的大小，就可以检测出cDNA样品中是否存在基因组DNA的污染。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

从西瓜基因组上(http://www.icugi.org)获取目标基因的序列和结构信息；用Primer3Plus设计引物，将正向和反向引物的结合位点分别放在两个相邻的外显子上，扩增产物大小设为80-150bp，在西瓜全基因组上检测目标基因的引物特异性，确定所设计的引物为该基因的特异性引物之后，分别以cDNA和基因组DNA为模板进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测，如在基因组DNA模板上扩增产物大于在cDNA模板上扩增的目标片段，则引物设计正确，如扩增失败，则选择另外的结合位点按照上述方法重新设计引物。同时，如果cDNA样品中扩增出了与基因组DNA为模板时大小相同的片段，则表明该cDNA样品存在基因组DNA污染，否则无基因组DNA污染。

本发明的特点在于：在基因表达分析的引物设计环节，不仅考虑到了基因的序列，还考虑到了基因的结构，通过将正向和反向引物的结合位点特异地设计在相邻的两个外显子上，根据以cDNA和基因组DNA为模板时PCR扩增产物的大小，来快速检测cDNA样品中是否有基因组DNA的污染。本专利利用该方法成功设计了西瓜中广泛存在的分子伴侣DnaJ蛋白基因(DNAJ)的特异性引物。

本发明的优点是：

(1)检测成本低：与常规的基因表达分析过程相比，本发明只需要在引物设计环节通过人工设定引物结合位点在基因上的位置，并增加一个基因组DNA为模板的PCR扩增环节，而不需要增加其他设备和试剂，因此检测成本非常低。