[发明专利]一种简便、快速、低成本的Hi-C文库构建方法

说明书

本发明提供一种简便、快速、低成本的Hi‑C文库构建方法。本发明Hi‑C文库构建方法不使用生物素标记及链霉亲和素磁珠，相比于传统方法，节约成本、操作简便、耗时少。

技术领域

本发明涉及一种可在全基因组范围内对染色质三维构象进行捕获的文库构建方法，属于基因测序技术领域。

背景技术

DNA是细胞遗传信息的载体，在生物体内以染色质的形式存在于每个细胞中，并控制着整个生命活动的进程。目前绝大多数对于DNA信息的研究是以研究DNA分子内碱基的序列(DNA的一维信息)来进行，通过分析碱基排列信息来探究生命活动的规律。

真实状态中的细胞核是一个狭小的三维立体空间，直链分子结构的DNA会以复杂的卷曲方式位于细胞核内，原一维DNA序列被赋予三维空间构象，并导致了大量复杂的基因调控作用方式。对此，简单的一维DNA序列信息由于不能提供真实DNA空间分布相关的信息，因此也无法解释由于空间构象导致的一系列基因调控现象。

为解决这一问题，目前已有一系列的检测方法。如3c(染色体结构捕获)方法及衍生的4c、5c方法。这些方法均以测序为基本检测手段，利用细胞核内蛋白形成DNA结构固定因子，之后通过对DNA的片段重联等构建带有空间结构信息的DNA序列，最后使用测序技术来检测染色质DNA信息，并计算其在空间中分布和相互作用。尽管此类方法在一定程度上能够提供部分染色质相互作用信息。但由于其方法与技术限制，这一类的检测仅能检测定点或部分的DNA相互作用位点，无法探究全细胞核水平上的立体互作信息。因此不可避免地大量信息将会遗漏。在对于未知相互作用信息的发现上，这一点尤为重要。

近年来随着高通量测序技术的出现，大规模基因组信息的获得变得更加容易。Hi-C技术便是结合高通量测序的方法，对整个细胞核内染色质的信息进行检测的技术。Hi-C技术是染色体构象捕获(Chromosome conformation capture，简称为3C)的一种衍生技术，是指基于高通量进行染色体构象的捕获，它能够在全基因组范围内捕捉不同基因座位之间的空间交互，研究三维空间中调控基因的DNA元件。

例如，专利文献1和非专利文献1报道了一种Hi-C方法，该方法利用甲醛固定染色质结构，然后通过限制性内切酶打断原基因组序列，并进行生物素标记后，再重新连接形成带有结构信息的新DNA分子。在这一过程中，如果两个不同基因组位置的DNA分子片段连接形成一个杂合分子，这将被认为是这两个DNA分子在空间上相互临近的证据。然后对DNA进行纯化并打碎，再针对标记的生物素分子进行钓取，富集获得所需的空间上相互作用的DNA杂合分子。最后构建高通量测序的文库及双端测序检测，获得全染色质在空间上的相互作用信息。该方法主要包括下述步骤：1)首先对样本细胞进行甲醛交联固定，使其内部空间距离较近的DNA通过蛋白交联在一起，并收集细胞；2)使用裂解体系并配合研磨进行细胞裂解，获得分离的细胞核；3)使用限制型内切酶(如EcoRⅠ)对交联后细胞的染色质进行酶切；4)对酶切末端进行生物素标记，同时补平形成平末端；5)使用DNA连接酶对平末端进行连接，处于同一个交联分子上的DNA片段间将有较大的概率连接形成新的分子；6)高温(65℃)处理逆转交联，提取重连的DNA分子；7)去除未连接的末端生物素标记；8)对DNA进行片段化，并进行生物素特异性调取，富集杂合分子连接位点区域；以及9)构建二代测序文库，进行双端测序，获得数据。

但是，该Hi-C方法的建库成本高。由于需要使用生物素标记的碱基以及用于亲和纯化的大量链霉亲和素磁珠，使得该方法的建库成本几十倍于基因组建库、表达谱建库、表观组建库等常见的高通量测序文库的建库成本。

此外，该Hi-C方法的操作复杂、操作时间长。由于需要对酶切片段进行生物素标记和末端修复补平、平末端连接、去除未连接末端的生物素标记、链霉亲和素磁珠钓取等多个繁琐的操作步骤，使得该方法十分耗费时间。