[发明专利]一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫层析条及其制备方法和用途，特别涉及一种用于检测甲型流感病毒的基于香豆素树状体的荧光免疫层析条及其制备方法和用途。本发明属于生物技术领域。

背景技术

流感病毒依据核蛋白(NP)抗原性分为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒。甲型流感病毒是导致人、动物传染性呼吸道疾病的主要病原。H1N1流感病毒或称为猪流感病毒，是由人流感病毒和猪流感病毒基因重组产生，在世界各地爆发流行。人感染禽流感病毒非常罕见，在人接触感染禽后引起禽流感病毒(如H5N1、H7N9或H9N2)感染，会引起呼吸道疾病症状甚至死亡。

甲型流感病毒跨越种属障碍在人-动物之间传播，引起流感大流行，对人和动物健康产生了严重影响，因此对于甲型流感病毒的检测非常有必要。通过至少3种甲型流感病毒主要亚型病毒(H5、H7、H9)定期筛选人-禽甲型流感病毒，对感染急性期快速检测流感病毒的存在，及时临床治疗和应急防控意义非凡。

目前流感病毒的检测方法有病毒培养、酶联免疫吸附(ELISA)、荧光免疫以及多聚酶链扩增技术，这些技术多用于医院和实验室，需要培训有素的技术人员和精密的实验室仪器。检测速度快、方便携带、容易操控、抗体的免疫学方法常被许多医院实验室、应急防治部门使用。以流感病毒核蛋白为检测靶点的快速流感诊断检测(RIDTs)也广泛在临床实践中应用。这些方法具有低廉、不需细胞培养、容易床旁或现场立即使用的优点，但由于常规RIDTs检测在检测甲型流感病毒时，常常会由于对病毒的敏感性不同导致在自动读板仪和可视观察中约有2.2％的检测结果不一致，因此RIDTs在作为流感病毒筛选工具使用受到限制。

为进一步改善甲型流感病毒检测的灵敏性，以磁性圆珠、纳米颗粒、荧光为基础的检测系统不断出现，但在整合到快速筛选的高级方法中时以及在现场使用和床旁检验中面临多处挑战。而在这些方法中，荧光材料是甲型流感病毒检测中非常出色的标记物。

香豆素树状体是一种新的荧光材料，可被光散二极管(LEDs)激活，在荧光酶联免疫吸附检测诊断中具有潜在的应用价值和良好操作性。

在本发明中，香豆素树状体被整合到甲型流感病毒含量丰富的核蛋白(NP)的单克隆抗体上，同时偶联乳胶圆珠，进而制成了一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条并建立了高度敏感的荧光免疫层析条检测法(fluorescentimmunochromatographicstriptestasssay，FICT)。通过LED-为基础的便携式条读数计即可检测禽和人甲型流感病毒的存在，该高度灵敏的诊断系统可检测定到纳米级含量的流感病毒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的用于甲型流感病毒快速检测的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条，其特征在于，所述层析条按照连接顺序依次包括样品衬垫，结合衬垫，醋酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述醋酸纤维素膜与结合衬垫之间有搭接，所述结合衬垫吸附有表面吸附甲型流感病毒核蛋白单抗以及香豆素树状体的乳胶圆珠；

其中，所述的醋酸纤维素膜上有羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及甲型流感病毒核蛋白另一单抗包被的检测线，样品衬垫提供了待测样品加入的位置；

其中，所述的香豆素树状体的结构如以下结构式所示：

在本发明中，结合衬垫表面吸附的单抗与检测线包被的单抗分别识别甲型流感病毒核蛋白的不同抗原表位。

在本发明的一个具体实施例中，表面吸附甲型流感病毒核蛋白单抗以及香豆素树状体的乳胶圆珠可通过以下方法制备的：

(1)将0.8ml直径20nm的乳胶圆珠用0.8mlpH8.5的0.1M碳酸氢钠溶液以及pH7.4的PBS先后分别洗涤3次，短暂离心，弃上清；

(2)沉淀中加入0.8mlpH8.5的0.1M碳酸氢钠溶液，再加入128μL溶于DMSO的浓度为1mg/mL香豆素树状体溶液，室温摇动1小时，得到结合香豆素树状体的乳胶圆珠；

(3)将结合香豆素树状体的乳胶圆珠用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用0.8ml含1mg/mL的甲型流感病毒核蛋白单抗溶液重悬，4℃孵育1小时；

(4)缓慢加入0.5mL戊二醛溶液，涡旋1分钟，4℃孵育2小时；

(5)用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用1mL0.1％牛血清白蛋白溶液重悬，4℃保存备用。