[发明专利]耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法

权利要求书

1.耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attl-400-attC的构建方法， 其特征在于，包括如下步骤：

S1、以440DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增，得440bpinsertion；

F：CGGGATCCAGGGCGAGGAGCTGTTCACC；

R：ACGCGTCGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTG；

S2、以NCBI报道attI和attC序列为模板，设计特异性引物并加入和载 体PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基，利用PCR技术扩增整合酶基因重组 位点attI和基因盒基因重组位点attC序列片段，然后将重组位点attI和attC 序列克隆到载体PUC19上；

S3、将步骤S1所得的PCR产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化 后和pUC19载体使用BamHlSall37℃C酶切1h，酶切体系如下：

PCR产物43μL、载体10μL、10Xbuffer5μL、10Xbuffer5μL、BamHl 1μL、BamHl1μL、Sall1μL、Sall1μL、ddH₂O33μL；

S4、将所得的酶切产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化后使用 PromegaT4DNALigase室温连接2h，转化DH5alpha感受态，得耐药性大肠 杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC；连接体系如下；

DNA片段3.5μL、载体1μL、T4DNALigase0.5MI、10Xligasebuffer 1μL。

2.根据权利要求1所述的耐药性大肠杆菌整合酶整合载体

pUC19-attI-400-attC的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的PCR反应 体系为：

10×PCRBuffer2.5μL；dNTP(2.5mM)1.6μL；primersF(5P) 1μL；primersR(5P)1μL；Taq(5U/μL)0.125μL；ddH2016.775μL； DNA2μL。

3.根据权利要求1所述的耐药性大肠杆菌整合酶整合载体

pUC19-attI-400-attC的构建方法，其特征在于，所述attI通过以下特异性 引物进行PCR扩增：

F：AATTC

tgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgcccta aaacaaagttaggcatcGAGCT

R：C

GATGCCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTT GCTGCTCCATAACATCAC。

4.根据权利要求1所述的耐药性大肠杆菌整合酶整合载体

pUC19-attI-400-attC的构建方法，其特征在于，所述attC通过以下特异性 引物进行PCR扩增：

F：G

gcctaacccttccatcgagggggacgtccaagggctggcgcccttggccgcccctcatgtcaaacgt taggtA

R；AGCTT

ACCTAACGTTTGACATGAGGGGCGGCCAAGGGCGCCAGCCCTTGGACGTCCCCCTCGATGGAAGGGT TAGGCCTGCA。

5.根据权利要求1所述的耐药性大肠杆菌整合酶整合载体

pUC19-attI-400-attC的构建方法，其特征在于，所述attI/attC片段使用以 下体系退火：

片段F(100μM)4.5μL；片段R(100μM)4.5μL；10Xannealingbuffer 1μL。