[发明专利]耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体 pUC19-attI-400-attC的构建方法。

背景技术

在抗生素的选择压力下，细菌耐药菌株不断的增加，其中细菌通过基因 的水平转移获得外源性耐药基因是细菌形成多重耐药的一种重要的途径。整合 子-基因盒系统介导的细菌耐药机制因能解释耐药基因的快速传播而倍受关 注。整合子可位于质粒、染色体或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移， 整合子由3个部分组成：5′保守末端、3′保守末端和两者之间的可变区。5′ 保守末端是整合子的基本结构，包括编码整合酶的基因(intI)、整合子重 组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)。IntI属于酪氨酸整合酶家族， 催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间的整合和剪 切。attC位点是一个不完全的反向重复序列，并含有一个可被整合酶识别的 特异性整合位点。attC位点的长度为57～141bp，其最高度保守的特征是两 个7bp的核心位点：核心位点GTTRRRY和与之相对称的反向核心位点 RYYYAAC。可变区是插入编码某种功能的基因，如耐药基因，称为基因盒(gene cassette)，目前发现了超过80多种包括抗生素耐药在内的基因盒。基因盒总 是以5′-3′的方向整合入整合子，使其可以在上游启动子Pant的作用下得 以表达。被捕获的基因盒5′端与整合酶的attI结合而3′端与attC发生 特异性整合。

2009年JuliaE等认为整合酶整合有两种机制。第1种：整合酶从整合 子(供体)中切除的一个基因盒，形成一个共价闭环，然后它插入到另一整合 子(受体)的attC位点；第2种：整合酶重组的供体和受体质粒，这些质粒 都是由attI或者attC位点所形成的单一的共联体质粒，它们可由整合酶分 成两个单独的质粒，一个质粒(受体)通过盒捕捉获得基因盒，另一质粒则失 去，这两种机制它们所形成的最后的盒捕捉产物通过序列测定是没有区别的。 2008年杨泽华博士做整合子捕获基因盒效率调控机制的研究，建立了测定整 合子捕获基因盒效率的新方法。2010年魏取好博士做了细菌整合子捕获与表 达耐药性基因盒调控机制的研究，建立了第1类整合子快速基因定位方法。基 因治疗工具酶phiC31在体外整合活性方法已经建立，人类免疫缺陷病毒HIV-1 整合酶体外活性检测方法也已建立，但是细菌耐药性整合酶体外活性测定方法 还没有成功。细菌通过整合子系统的整合酶，捕获外来的耐药基因，使细菌具 有耐药及多重耐药性，造成细菌多重耐药性的传播。研究表明大肠杆菌I型整 合子的检出率呈上升趋势，细菌在整合子捕获基因盒的时候整合酶起着非常重 要的作用，因此如果构建一个质粒载体模型，用来检测细菌耐药性整合酶体外 整合的活性，可以为寻找抑制整合酶活性的方法打下基础。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体 pUC19-attI-400-attC的构建方法，该载体含有attI和attC重组位点且在 attI和attC位点之间间隔440bpDNA序列的重组载体，可以用来研究耐药性 大肠杆菌整合子捕获外来的耐药基因的过程、效率、机制。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法，包括 如下步骤：

S1、以440DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增，得440bpinsertion；

F：CGGGATCCAGGGCGAGGAGCTGTTCACC；

R：ACGCGTCGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTG；

S2、以NCBI报道attI和attC序列为模板，设计特异性引物并加入和载 体PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基，利用PCR技术扩增整合酶基因重组 位点attI和基因盒基因重组位点attC序列片段，然后将重组位点attI和attC 序列克隆到载体PUC19上；

S3、将步骤S1所得的PCR产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化 后和pUC19载体使用BamHISalI37℃酶切1h，酶切体系如下：