[发明专利]一种经济有效的细菌细胞破碎方法

说明书

摘要

本发明公开了一种经济且快速有效的细菌细胞破碎方法，该方法根据反复冷冻与融化可以使细胞破裂的原理，采用液氮冷冻细胞组织与30℃恒温水浴融化细胞组织技术，达到细菌细胞破碎的目的，若结合溶菌酶处理，效果更佳。这种方法简单方便，适用于大多对温度变化不敏感的蛋白质的分离纯化前期细胞破碎处理。本发明的优点在于成本低，耗时短，效果好，操作易掌握，尤其针对小型实验室及个人实验室，设备少，经费有限的情况，可以推广此种方法对细菌细胞进行破碎。使用此方法能够在较短时间内获得大量的细菌细胞破碎液，为蛋白质的进一步分离提纯奠定良好的基础。现有已知方法使用大型仪器如细胞破碎仪、超声波破碎仪或-80℃低温冰箱等对细菌细胞进行破碎，具有投资成本高，劳动成本高，技术难于掌握，耗时长，效果较差等弊端问题；而此方法所使用的细菌细胞破碎设备不涉及大型仪器，实验室仅需具备液氮和液氮罐即可完成操作，较现有方法具有成本更低，操作更易掌握，耗时更短，效果更好的特点，有效地突破了现有已知方法破碎细胞带来的弊端问题。这种方法的推广是对倡导经济节约型社会及经济转型发展号召的一种响应。

技术领域

本发明涉及一种细菌细胞破碎技术领域，具体涉及到反复冻融与溶菌酶结合原理破碎细菌细胞技术。

背景技术

细胞破碎技术有很多，这些技术的普及在于人类向微观研究领域深入的一种需要，人们需要获得细胞内含物质，包括DNA和蛋白质等，一般为得到有活性的蛋白质，需要找到合适的破碎方法。不同的生物体，有不同的处理方法，由于细菌细胞壁的特殊结构，使得细菌细胞壁较其他生物细胞（如动物细胞）更难破碎，所以，关于如何破碎细菌细胞的问题成为研究热点之一。虽然，目前已经出现多种细菌细胞破碎方法，包括利用细胞破碎仪及超声波破碎仪这些机械破碎法，及利用-80℃与37℃反复冻融法等，但经过分析比较发现，这些方法的使用有以下几种弊端：其一、这些方法都需要大型仪器设备细胞破碎仪、超声波破碎仪或-80℃低温冰箱等，价值不菲，尤其对小型实验室或技术资金不足的个人实验室来说，购买这些仪器是笔不小的开支；其二、使用细胞破碎仪这种机械破碎法涉及的具体问题是在仪器有限的情况下，每次可处理的材料体积有限，规模较小。而使用超声波破碎仪这种机械破碎法涉及的具体问题是如何设定破碎参数，稍有不慎就容易造成材料的碳化现象，引起材料的质量下降和浪费等具体问题；其三、-80℃与37℃反复冻融这种方法涉及的具体问题是用-80℃冷冻溶液，耗时较长，劳动成本高，并且其效果不如使用液氮冷冻溶液破碎细菌细胞的效果。

发明内容

为优化细菌细胞的破碎方法，改善现有已知方法破碎细胞带来的弊端问题，如投资成本高，劳动成本高，技术难于掌握，耗时长，效果较差等，发明此法。本发明提供一种投资成本低，劳动成本低，技术易掌握，耗时短，效果更佳的细菌细胞破碎方法，通过下列技术方案实现。

本发明提供的是这样一种细菌细胞破碎方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）收集细胞细菌细胞沉淀物：将待破碎的细菌细胞培养液均分为N份分装于N个相等型号的EP管中（事先洗净灭菌），放于4℃低温高速离心机中，对称平衡，8000rpm-16000rpm离心1-5min。去除上清液，收集细胞沉淀物；

（2）溶菌酶处理：每管中分别加入适量溶液A（3.0mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH=7.9），使细胞体充分重悬后，各加入溶菌酶(50mg/mL)充分混合，至终浓度为1mg/mL-2mg/mL。冰浴0.5h-1h，或4℃过夜；

（3）反复冻融：将上述EP管放在液氮中，迅速使其凝固。待其完全凝固后，取出EP管放在30℃水浴锅中，使其充分溶解。注意溶解时要不断摇晃EP管，避免EP管管壁温度太高，而使蛋白质高温变性；

（4）重复步骤(3)，使细胞反复冻融5-7次。待溶液呈粘稠状时，停止冻融；

（5）根据所需提取的内含物的性质不同，对上述细胞破碎液进行不同处理，如需获得蛋白提取液，下一步可对此溶液进行离心处理，去除沉淀。