[发明专利]一种高纯人凝血因子IX的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种人凝血因子IX，具体来说是一种高纯人凝血因子IX的制备方法。

背景技术

人凝血因子IX(FIX)是人体十三种凝血因子中的一种，在人体凝血机制中扮演非常重要的作用。因缺乏凝血因子IX而导致凝血障碍即为乙型血友病，该病是一种遗传性疾病，患者以男性为主，发病率约为男性活婴的1/30000，以自发性或创伤相关的出血为特征，出血部位主要在关节、软组织和肌肉。治疗的延迟或不足会引起各种并发症，包括关节反复出血相关的关节病和滑膜炎，严重时可导致关节畸形和功能障碍。另外，更严重的出血，尤其是颅内出血可能导致死亡。

目前治疗乙型血友病唯一有效的方法就是及时注射含凝血因子FIX的药物以达到止血的目的，或者规律性注射含凝血因子IX的药物预防出血。含凝血因子FIX的药物有血浆提取的人凝血因子FIX、人凝血酶原复合物以及基因重组的人凝血因子IX等，国外有冻干人凝血因子IX及重组人凝血因子IX制品，国内目前只有冻干人凝血酶原复合物品种。临床实践表明，乙型血友病人可以自我注射纯的人凝血因子IX，通常不会有副作用，是比较安全的，但是注射人凝血酶原复合物却可能产生严重的副作用―血栓症，所以一般乙型血友病人输注该药时需在医院注射，留院观察以防意外。可见，纯化的人凝血因子FIX是治疗乙型血友病的首选药物，但传统的纯化人凝血因子IX生产工艺，工序较多，成本很高，且在生产过程中易出现凝血酶激活的问题而致产品失败，再加上传统工艺的病毒灭活手段单一，不能完全保证制品的安全，而干热病毒灭活方式往往导致较大的活力损失，所以，长期以来，纯化的人凝血因子IX一直未能取代虽有副作用但成本低廉的人凝血酶原复合物，

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种高纯人凝血因子IX的制备方法，所述的这种高纯人凝血因子IX的制备方法解决了现有技术中制备人凝血因子IX的方法工序复杂、成本高，产品安全性不高的技术问题。

本发明提供了一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：

1)将新鲜冰冻血浆融浆后离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆，然后将去冷胶血浆加热至10-15℃；

2)将DEAE-SephadexA-50凝胶置于一个不锈钢树脂桶中，先用温度在75～85℃的注射用水充分溶胀，再用10～20℃的注射用水冷却，然后用缓冲液平衡，所述的缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate(柠檬酸钠)的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.075M-0.15M，所述的缓冲液的PH为6.50-7.50，将上述平衡好的凝胶加入到去冷胶血浆中，按照每升去冷胶血浆加入0.5-1.5克干凝胶的比例加入平衡好的凝胶，搅拌0.5-1.5小时，再静置10-20分钟；

3)过滤去冷胶血浆，收集吸附了凝血因子IX的DEAE-SephadexA-50凝胶，后用洗涤缓冲液冲洗树脂4-6次，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.1M-0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50-7.50；再用洗脱缓冲液洗脱树脂2-4次，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride(盐酸精氨酸)和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M-2.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50-7.50，收集洗脱液，然后用0.45μm或1.0μm滤芯过滤洗脱液，收集滤液，即为凝血因子IX粗品溶液；

4)在过滤后的洗脱液中加入聚乙二醇，加入后的聚乙二醇在洗脱液中的质量百分比浓度为2-6％，搅拌0.5-1.5小时，过滤；

5)在上述的滤液中加入Tween80，加入后的Tween80在上述滤液中的质量百分比浓度为1.0％，再加入磷酸三丁酯，加入后的磷酸三丁酯在上述滤液中的质量百分比浓度为0.3％，搅匀后升温至24-26℃，后保温6～7小时；