[发明专利]一种变换核酸基因型的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种变换核酸基因型的方法，其包括步骤：提供含有不同等位基因型的混合标本，对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏；利用被选择性破坏后的断裂片段以其他等位基因的目的基因型核酸片段作为模板进行核酸延伸反应；后面两个步骤的重复进行。本发明的方法在基因定性与定量分析方面具有应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及医学诊断和生物技术。

背景技术

选择性扩增核酸和选择性破坏核酸，在核酸分析领域已有许多成功的应用例证。一个选择性扩增核酸的最有价值的例子是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。PCR因其应用十分广泛，已获诺贝尔奖。另一个选择性扩增核酸的例子是采用一定比例的双脱氧单核甘酸介导的部分链终止法核酸扩增，也即Sanger’s经典测序技术，该技术也已获诺贝尔奖。

两个选择性破坏核酸的例子为采用识别核酸不同碱基的化学试剂对核酸进行部分降解，这是世界上最早出现的实用测序技术即化学裂解法测序，也已获诺贝尔奖。另一例子为核糖核酸酶保护分析用于核糖核酸的定性与定量分析。

核糖核酸酶保护法主要用于实验研究，该方法可用以从细胞中提取出来混杂的RNA样本中鉴定出单独的RNA或多种RNA。此技术可以在即使总浓度很低的情况下鉴定一种或多种已知序列的RNA分子。被提取出来的RNA首先与反义RNA或DNA探针相混合，探针是与被研究的序列相互补的，接下来互补链相互杂交以形成双链RNA(或DNA-RNA杂交分子)。然后将混合物使用具有特异性地切割仅为单链的RNA的核糖核酸酶，而不对双链核酸分子发挥酶解作用。当反应进行完全时，易受影响的RNA区域被降解为非常短的低聚物或单个核苷酸；存留下来的RNA片段是与之前所加进的反义链相互补的RNA，因此包含目的序列。获得保护的目的序列片段通过后续电泳或其他分析技术得以确认。但是，核糖酶保护分析法只应用了选择性破坏核酸，而未同时采用选择性扩增核酸。

上述例证都为单独应用选择性扩增核酸或选择性破坏核酸。但上述例子中的单独反应，在同时含有不同等位基因或野生序列片段和突变片段的混合标本，尤其是当混合标本中的大多数基因片段均为非目的片段而其中稀有的基因型为目的片段时，如何通过技术手段得到较高含量的稀有基因型产物，是常规基因扩增技术难以满足的难点。

而现实世界的许多生物标本，如尿液提取的游离核酸，粪便提取的游离核酸，血液提取的游离核酸，以及动植物的组织核酸提出物等，在用于基因克隆或基因突变分析时的难点是在大多数情况下，是特定目的基因型片段较少，或野生序列片段含量高而突变序列含量过低,以及特定基因片段较短等。一种有用的技术方案为首先对目的基因型片段进行富集。BEAMing技术平台即采用先富集突变序列然后再对其进行分析的技术路线。其存在的缺陷是：(1)富集效率较低；(2)此外，富集需要针对变化多样的不同种可能的突变序列；(3)富集难以对基因组数量巨大的突变序列设计和生产相应的富集材料。尽管PCR结合测序分析存在假阳性,但仍具有高敏感性,临床上得到较广泛应用。但是,当突变片段较设计的引物对包含的范围更段时,PCR不能扩增突变片段,从而测序也无法得到突变片段的信息。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以在混合有不同等位基因或混合有野生与突变基因片段的生物标本中选择性提高目的基因型基因片段的方法。通过破坏特定基因型对应的基因序列，利用DNA聚合酶对上述基因被破坏过程所产生的部分可延伸断裂片段进行延伸反应。延伸反应的产物中已转换基因型的部分在下一次反应中作为模板使用，而未转化基因型的部分产物将被基因破坏反应所破坏。

为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种体外变换核酸基因型的方法，其包含如下步骤:

(1)提供含有不同等位基因型的混合标本，其包括目的基因型核酸片段和特定基因型核酸片段；

(2)对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏；