[发明专利]一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法

权利要求书

1.一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、取新鲜秋茄叶片剪碎后，每1g样品加入0.1g的PVPP，于研钵中用液氮充分研磨，将研好的粉末转移至预冷的离心管中；

(2)、用TCA/丙酮对步骤(1)离心管中的粉末进行洗涤，每1g样品加入5ml预冷含质量体积比为10％TCA的丙酮，涡旋，充分震荡后离心，弃上清；

(3)、用含有0.1M醋酸铵的体积分数为80％甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值达到7以上，离心后去除上清；

(4)、加入体积分数为80％丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，离心后去除上清；

(5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮；

(6)、提取并沉淀蛋白：每1g样品加入8ml体积比为1:1的苯酚/SDS缓冲液，其中，苯酚的pH值大于等于7.8，充分混匀并孵育，离心，将上层酚相转移到新的离心管，加入5倍体积的含有0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀过夜，离心后弃上清，留沉淀；

(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80％丙酮和纯丙酮各洗涤一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后离心弃上清，留沉淀；

(8)、吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉；

(9)、将步骤(8)得到的蛋白干粉保存备用或进行蛋白裂解：向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，孵育，期间不时地颠倒混匀，蛋白质充分溶解，离心后所得的上清即为适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白；所述的样品裂解液，其配方为：7M尿素，2M硫脲，质量体积比为4％CHAPS，体积比为0.2％pH值为4-7的两性电解液，50mM DTT，2mM TBP，0.1mM PMSF。

2.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的SDS缓冲液，其配方为：质量体积比为30％的蔗糖，质量体积比为2％SDS，0.1M pH值为8.0的Tris-HCl，体积比为5％的β-巯基乙醇，1mM PMSF。

3.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的沉淀过夜，其温度为-20℃。

4.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，步骤(9)所述的孵育，是在35℃下孵育2h。

5.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，所述的两性电解液为IPG buffer。