[发明专利]一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法

说明书

本发明公开一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。本发明通过联合传统蛋白提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同时引入助溶剂SDS溶液，并优化提取过程，建立了一种适合红树植物秋茄叶片总蛋白提取的Phe‑B方法。本发明有效地提高了蛋白质的提取效率和质量，其技术方案可专门适合于双向电泳的秋茄叶片蛋白的提取。本发明方法具有操作简单、蛋白提取效率高、干扰物质少的特点，适合于蛋白提取困难、蛋白提取效率低、干扰物质多的材料。本发明所提取的秋茄叶片蛋白完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、蛋白点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的高质量双向电泳凝胶图谱，且实验重复性和稳定性好。

技术领域：

本发明涉及蛋白组学研究领域的一种红树植物蛋白提取与分离方法，具体涉及一种稳定、高效的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。

背景技术：

红树林是生长在热带、亚热带海湾、河口泥滩上特有的以红树植物为主体的常绿灌木或乔木组成的海洋湿地生物群落，是重要的海洋湿地生态系统。红树林在防风消浪、护堤固岸、促淤固滩、净化水体和维持沿海湿地生物多样性等方面具有重要作用和巨大的社会经济效益。目前，全球极端天气气候对红树林的生存和发展产生了直接的影响，秋茄，作为红树植物的常见物种，是抗寒性最强、分布最广的红树物种之一，如何从蛋白质水平上研究红树植物秋茄对逆境的响应与适应机制对应对全球变化具有重要科学意义。

双向电泳是在蛋白水平上研究复杂基因表达非常有效的方法，为了获得好的结果，高质量的蛋白样品制备是蛋白组学研究中最重要的步骤之一。然而，蛋白样品提取过程中经常会发生共沉淀或其他非蛋白物质的污染。由于红树植物中常含有大量的其他物质，如单宁、盐分、色素、多糖、多酚、脂类、淀粉、蛋白酶、细胞壁、液泡和其他刺激代谢产物等，严重地影响了蛋白质的提取分离，并且红树植物中蛋白的含量相对较低，使蛋白的提取变得更加困难。秋茄叶片组织中的这些干扰物质含量非常高，使得秋茄叶片蛋白的提取尤其困难，如何获得高质量的蛋白对于秋茄蛋白组学的研究显得至关重要。

三氯乙酸-丙酮沉淀法(简称TCA-A法)是开展绝大多数植物蛋白组学研究最基本的方法。TCA-A法已经成功用于不同的植物组织蛋白提取，如木材组织、玉米叶片等。尽管TCA-A法可以增强蛋白的共沉淀作用，并有助于去除杂质，然而一些聚合物杂质也常常一起被共沉淀；此外，TCA-A法的另外一个缺点就是蛋白被TCA-A沉淀后，蛋白不能完全再溶解。在秋茄叶片蛋白组学研究中，TCA-A法提取的蛋白在双向电泳图上显示出了明显的纵条纹和拖尾现象。蛋白提取的另一个常用基本方法就是苯酚提取法(简称Phe法)。Phe法可以追溯到19世纪50年代。在一些植物蛋白提取中，苯酚被发现是一个能将蛋白从水溶液中提取的有效试剂。然而，以往的研究表明，Phe法仍然不能很好地将干扰物质从红树植物中去除，如秋茄(Kandelia candel)(Wang,L.G.,Liu,X.,Liang,M.,et al.Proteomic analysis ofsalt-responsive proteins in the leaves of mangrove Kandelia candel duringshort-term stress.Plos One,2014b,9(1):e83141.DOI:10.1371/journal.pone.0083141)、木榄(Zhu,Z.,Chen,J.,Zheng,H.L.Physiological andproteomic characterization of salt tolerance in a mangrove plant,Bruguieragymnorrhiza(L.)Lam.Tree Physiology,2012,32(11):1378-1388.)和红海榄(吉星,邓用川,黄惜等.红海榄根部盐胁迫反应的比较蛋白质组学分析.中国生物化学与分子生物学报,2009,25(1):72-77.)等。以往研究中用Phe法获得的蛋白进行的双向电泳图谱中，存在着高背景值，这表明还是有很多干扰杂质的存在。目前，有关双向电泳在红树植物中的应用报道还较少，尤其在红树植物蛋白组学研究中还没有很好的蛋白提取方法。

发明内容：