[发明专利]一种使用家蚕制备镇痛多肽的方法

说明书

本发明公开了一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的方法，属于基因工程领域。所述制备方法如下：根据家蚕核型多角体病毒（BmNPV）密码子使用频率优化芋螺毒素ω‑MVIIA基因序列，经化学合成后连入供体质粒pFastBacDual，再引入绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建重组供体质粒pFBD‑MVIIA/EGFP。使用Bac‑to‑Bac方法将MVIIA/EGFP转座到BmNPV，形成重组病毒vBm^MVIIA/EGFP。将重组病毒DNA转染至家蚕细胞，获得BV粒子，借助绿色荧光测定BV粒子滴度后，以200 pfu的BV粒子注射家蚕，感染5天后，收获家蚕血液。通过小鼠醋酸扭体试验证实，表达芋螺毒素ω‑MVIIA的受感染家蚕的血液具有显著的镇痛活性，平均扭体次数仅3.55次，明显高于注射生理盐水的对照组（37.30次）。本发明为表达具有镇痛活性的芋螺毒素ω‑MVIIA提供了新的方法，具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明公开了一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的方法，属于基因工程领域。

背景技术

芋螺毒素是由海洋软体动物芋螺(Conus)分泌的一类用于自卫和捕食的活性肽类毒素。芋螺毒素分子质量小，通常由10-30个氨基酸残基组成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。芋螺毒素种类繁多，可达5万种以上，其一级结构多变，但信号肽及前导肽序列保守。根据保守的信号肽序列，芋螺毒素可分为：A、M、O、I、P、 S、T等超家族（superfamily），再依据家族中毒素的半胱氨酸骨架，结合其药理活性，又可分为α、μ、ω、δ、Ψ、σ、λ、κ、γ等家族（family）。芋螺毒素能特异性地作用于体内多种（钾、钠、钙等）离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递。因此，在治疗慢性疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运动失调、痉挛症、癌症及中风等方面具有广泛的应用前景。如O-超家族中的ω-芋螺毒素可直接作用于钙离子通道，阻断痛觉传递，并具有镇痛效应。由于芋螺毒素在作为分子探针用于神经药理研究及作为新型药物前导物开发临床用新药方面具有极高的研究和利用价值。在芋螺毒素中，ω-MVIIA来源于海洋生物幻芋螺（Conus magus，也称僧袍芋螺），能特异地阻断钙离子通道，阻止疼痛信号的传导，以其为有效成分的Ziconotide（商品名Prialt^TM）已被FDA批准用于治疗慢性疼痛（Terlau, Olivera. Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiol Rev. 2004, 84: 41-68）。

目前，芋螺毒素的获得主要是依赖于芋螺的天然毒液的提取。但是，由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生态平衡。因此，利用经典的生化提取的方法直接从芋螺中分离芋螺毒素已经难以满足研究和药物生产的需要，从而使芋螺毒素的深入研究及开发受到一定限制。许多科学家希望采用多肽固相合成的方法来解决这一困难，其技术路线是通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。一些结构简单的芋螺毒素，如已经得到应用的ω-MVIIA，已可通过化学合成法来获得。但是人工合成芋螺毒素的成本很高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。因此，有科学家提出可将芋螺毒素的基因转化到大肠杆菌或酵母等微生物中表达，但芋螺毒素的氨基酸序列短，后期分离纯化比较困难，且翻译后修饰复杂，在微生物表达系统中无法解决C端酰胺化的问题，不能获得高活性的重组芋螺毒素（Zhan et al. A fusion protein of conotoxin MVIIA and thioredoxinexpressed in Escherichia coli has significant analgesic activity. BiochemBiophys Res Commun. 2003, 311: 495-500）。