[发明专利]含反义碱基的探针法实时荧光PCR

权利要求书

1.含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所选的TaqMan及MGB探针离5’端5至20个碱基的中部序列中引入1至5个反义2’-O-Methyl碱基或2’-F-RNA碱基；其关键特征在于中部含反义碱基的寡核苷酸荧光TaqMan/MGB探针保留其5’端荧光基团标记的正常碱基序列仍旧能被Taq聚合酶5’外切酶活性所识别、水解；但探针失去了作为PCR扩增模板作用，引物非特异结合探针序列后Taq聚合酶不能识别反义碱基的模板而不能延伸、扩增，从而减少了内源性的引物-探针的聚合非特异性扩增。

2.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所述的改良探针法实时荧光PCR采用中部6-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体PD程度，从而减少对靶扩增的竞争性抑制，提高灵敏度。

3.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所述的改良探针法实时荧光PCR探针3’末端添6-8个与其5’端反向互补的碱基序列，再标记淬灭基团，增加自身结合，而即降低荧光反应基线，又减少与引物结合的概率。

4.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所述的PCR反应液加等体积的矿物油单独使用，封闭反应液，不联用热盖条件。

5.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所选的TaqMan/MGB探针离5’端10-15个碱基的中部序列中引入1至3个反义2’-O-Methyl碱基或2’-F-RNA碱基。

6.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，2.5U/ul Taq聚合酶加入0.1-2U/ul的UDG酶，消除PCR产物气雾胶的可能交叉污染。

7.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR技术应用试剂盒，成份包括：核酸提取试剂，底物dNTPs，Taq聚合酶及其缓冲液，UDG酶，荧光探针，引物，去离子水。