[发明专利]含反义碱基的探针法实时荧光PCR

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及采用反义碱基的探针法实时荧光PCR来减少引物-探针聚合的非特异性的技术领域。

背景技术：

早在1953年，核酸DNA双螺旋模型及其中心法则开创了现代分子生物学及奠定了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的基础，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但直到1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Muliis在研究核酸测序技术时产生了指数扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件：模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，经过DNA变性---退火---延伸的循环过程，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子几百万倍。经过一系列探索发展，耐热DNA聚合酶和热循环仪的发明与应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

PCR技术以其独有的特异性强、灵敏度高、简便快速和纯度要求低的特点而成为生命科学研究的核心基础技术。但传统的PCR(又称为终末PCR)需将产物凝胶电泳检测进行结果分析，传统的PCR由于PCR产物变异大的局限性，只能检测反应终末产物的定性而不能精确定量，同时也没有解决气雾胶污染、引物二聚体、非特异性扩增等难题，因此传统的PCR结合产物凝胶电泳检测方法不适用于临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。1996年由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对靶模板进行定量分析的方法。扩增产物荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数即Ct值(Cycle threshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负线性相关关系，即起始模板稀释一倍达到设定的阈值就要增加一个循环数(Ct)。该技术实行完全闭管式操作，避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性结果的出现，同时也避免了对环境的污染。相比于传统PCR电泳的方法，该技术操作简便，检测结果以更客观的数据形式展现，从而对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，保证了结果的准确性。

实时荧光定量PCR扩增产物增加的荧光信号既可通过荧光染料(如SYBR Green I)显示，又可采用带淬灭基团的荧光探针来检测。染料法即在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于传统PCR引物二聚体非特异性扩增产物干扰的假阳性问题。探针法即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与染料法相比，探针法在一定程度上避免了假阳性问题的出现，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加了结果的可信度。