[发明专利]转基因水稻PA110-15品系特异性5’端定量PCR检测引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因水稻PA110-15品系特异性5’端定量PCR检测引物及其检测方法。

背景技术

目前，关于转基因食品的安全性受到人们越来越广泛的关注，转基因食品的安全性成了人们较为关注的话题，在市场上出售的粮油，蔬菜，瓜果等农产品也都打出非转基因的招牌来吸引客户，但是，所购买的食品是否为非转基因食品，是否掺杂了转基因食品，掺杂的量是多少，普通的消费者无法鉴别。

转基因食品中，粮食作物的转基因尤其受到人们的关注。鉴别转基因作物的一个有效的方法是PCR检测插入基因序列，但是，很多转基因的作物材料转入的基因在其非转基因亲本中也含有该基因或者该基因的类似基因，会对PCR的结果造成干扰。在应用PCR技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。

专利CN201410081539公开了转基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测引物及定性检测方法和试剂盒。专利CN201410081893公开了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应用。这两个专利都是从转基因水稻PA110-15插入的旁侧序列入手，设计检测的引物，达到了检测特异性的目的，但是，在实际应用中，消费者不仅要了解其购买的大米中是否含有该转基因品系，而且，还要了解是否全部为该转基因大米的品系，或者部分是，掺杂的量(含量)为多少。目前，这两个专利所设置的引物只能做定性检测，无法实现定量检测。

发明内容

本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，通过筛选得到转基因水稻PA110-15品系特异性5’端定量PCR检测引物。

定量检测一般采用荧光定量PCR的方法，引物的设计是成败的关键，对于本发明，计算PCR的特异性引物的荧光量与内参基因荧光量的比值即为转基因品系的掺入量，为了使该比值检测接近于真实情况，需要对内参引物和特异性引物进行选择优化，具体，我们是采用如下方法筛选到合适的内参引物和特异性引物的：1)根据引物设计的基本原则，设计三组引物；2)采用实验的方法对引物进行评价，筛选出最适合的引物。评价内容：是否有荧光信号的产生；实时荧光PCR反应体系扩增时，特异性引物和内标准基因引物能构建标准曲线，且标准曲线的R²≥0.98，扩增效率在90％～110％之间；能准确的检测水稻产品中转基因含量。

一种转基因水稻PA110-15品系特异性5’端定量PCR检测引物，所述特异性引物为：PA110-5-qF，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；PA110-5-qR，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示；所述特异性引物的探针序列如序列表SEQIDNo.3所示。

一种转基因水稻PA110-15品系特异性的定量检测方法，按照如下步骤进行：

(1)提取待检测水稻样品的DNA；

(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，设定水稻内源基因实时荧光PCR反应体系和PA110-15水稻品系特异性实时荧光PCR反应体系，将上述体系放入96孔PCR板；

(3)将96孔PCR板放在水平低速离心机中，2000rpm离心30s，然后放入PCR仪中；

(4)运行实时荧光PCR反应，若特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明样品中不含有转基因PA110-15水稻品系；

(5)若特异性实时荧光PCR反应体系扩增出目的荧光信号，则证明样品中含有转基因PA110-15水稻品系，根据标准梯度样品读取的特异性实时荧光PCR反应的Ct值和水稻内源基因实时荧光PCR反应的Ct值。以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线(Ct＝k×Lg(Copies)+b),分别得到一条内源标准曲线方程和一条外源标准曲线方程。再将待测样品中Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数。然后按下述公式计算转基因含量:样品中转基因PA110-15水稻品系的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数。