[发明专利]一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种高效制备一型极化树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制备T细胞的培养基上清；

步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养；

步骤3，步骤2中培养物加入10％-40％比例的T细胞的培养基上清继续培养，获得DC1细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中制备T细胞的培养基上清时，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清，经30μm滤网过滤后，-80℃度保存备用或直接用于DC1细胞的诱导。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，按照2*10⁶/ml密度接种至TakaraGT551-H3培养基中。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，分离外周血中的单核细胞按密度3.0×10⁶/ml接种至T75培养瓶中培养，培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-4以及10％血浆的培养基，贴壁细胞培养第3天、第5天更换一半量的培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的贴壁培养是指在培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境条件下的培养。

6.一种如权利要求1-5任意一项所述方法制备的一型极化树突状细胞。

7.一种治疗肿瘤的组合物，其特征在于，由如权利要求1-5任意一项所述方法获得的DC1细胞进行肿瘤抗原肽负载而得到。

8.一种制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，其特征在于，包括以下操作：分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0～3.0×10⁶个/ml添加扩增培养基，培养基中添加1000U/ml的IL-2，每隔两天倍比添加培养基，至第五天加入诱导剂IFN-γ培养24小时，然后加入诱导试剂IL-1α及CD3并与权利要求7所述的负载了抗原肽的DC1细胞混合培养；混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽；培养15-20天，收集细胞。

9.如权利要求8所述的方法制备的肿瘤抗原特异性CTL细胞在制备抗癌药物中的应用。