[发明专利]一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用。

背景技术

DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。活化的DC细胞高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，肿瘤抗原被细胞捕获，加工之后与MHC分子结合，形成肽-MHC分子复合物。随后DC细胞表面的肽-MHC分子复合物，与T细胞表面一系列分子结合，完成抗原递呈过程，T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性CD8阳性细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ类限制性的CD4阳性的一型T辅助细胞(type1Thelper,Th1)。活化的DC细胞高表达CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等刺激分子，为T细胞激活提供第二信号。成熟的DC细胞在激活T细胞过程中还大量白介素12(interleukin12，IL12)等因子，促进活化的T细胞迅速增殖。

一型极化树突状细胞(Type1PolarizedDendriticcell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DC1细胞的重要的特征是高表达IL12p70以及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞相关的免疫反应。RobbieB.Mailliard等证实了DC1体外诱导黑色素瘤抗原特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍以上ref.1α-Type-1PolarizedDendriticCellsANovelImmunizationToolwithOptimizedCTL-inducingActivity。AdrianaTLarregina等人还发现DC1细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅助性T细胞对肿瘤组织的浸润。Ref.2Tumorcellloadedtype-1polarizeddendriticcellsinduceTh1-mediatedtumorimmunity.DC1细胞的上述特性为增强肿瘤疫苗的治疗效果提供了一种更为有效的选择，DC1细胞可以作为一种佐剂促进肿瘤特异性的免疫反应激活。目前已经有多个基于DC1细胞的治疗性肿瘤疫苗已经进入临床研究阶段。

目前体外制备DC细胞方案都多数基于Jonuleit等人提出方案，诱导试剂包含了干扰素、脂多糖、肿瘤坏死因子等。经过这类方案制备的成熟DC细胞具有肿瘤抗原特异性CTL细胞的诱导能力，但是大量临床试验数据显示基于DC细胞的癌症疫苗的治疗效果无法令人满意。因此，对于高效的DC细胞癌症疫苗或DC细胞癌症免疫治疗技术来说，需要进一步提高体外获得的DC细胞免疫反应诱导能力。XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12，发现DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肽回输至小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。该研究提示了高表达IL12的DC细胞对于肿瘤疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。因此，IL12高表达的DC1细胞可以用来提高肿瘤疫苗临床治疗作用。美国专利US7972847B2公开了一种无血清的DC1细胞制备方法，可获得高表达IL12的DC1细胞，但是该方案需要大量的细胞因子，成本较为昂贵。由于细胞因子批次间可能存在效价差别，对于制备的质量控制工作带来了大量的负担。

发明内容

针对现有技术的种种不足，本发明利用T细胞在DC细胞分化与成熟过程中的辅助作用，建立了一种新的DC1细胞制备方法。通过采集癌症病人外周血，从中分离DC细胞，使用T细胞培养上清的培养基对其进行体外诱导，获得富集DC1细胞的产物。这些细胞不仅显现出成熟DC细胞表型，IL12p70的表达量也显著性提高，而且其体外诱导肿瘤细胞特异性CTL的能力也获得加强。

为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种高效制备一型极化树突状细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1，制备T细胞的培养基上清；

步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养；

步骤3，步骤2中培养物加入10％-40％比例的T细胞的培养基上清继续培养，获得DC1细胞。

为了进一步优化上述技术方案，本发明提供的技术措施还包括：