[发明专利]转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因水稻外源基因插入的纯合/杂合状态检测的方法，特别涉及转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物及其检测方法。

背景技术

标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是依法开展转基因生物安全监管的重要物质基础。转基因成分检测标准物质研制对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。

此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，也有利于缩短育种进程。

目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体构建特征的构建特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。迄今未止，国内外目前还没有针对转基因水稻PA110-15外源基因纯合/杂合状态的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供检测转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物。

本发明的目的还在于提供转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测方法。

本发明的目的还在于提供转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒。

一种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物，所述引物为：PA110-LA-F，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；PA110-LA-R，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。

专利CN201410081893公开的了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应用。本发明根据PA110-15外源插入片段旁侧序列信息，在水稻染色体部分设计出一对能够准确检测转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物。

一种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测方法，按照如下步骤进行：

(1)提取待检测水稻样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；

(3)如果仅扩增出一条3856bp片段，则待检测的样品为纯合转基因水稻PA110-15；如果扩增出3856bp和751bp的两条片段，待检测的样品为杂合转基因水稻PA110-15；如果只扩增出一条751bp片段，待检测的样品为非转基因水稻。

其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或经验证适用于植物DNA提取的试剂盒等各种方法。

所述PCR扩增体系按照以下方式建立：反应体系的总体积为25.0μL，其中，10×LATaqBufferII(Mg²⁺Plus)缓冲液2.5μL，5U/μL的TaKaRaLATaq聚合酶0.25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4.0μL，10μmol/LSEQIDNo.1所示的引物1μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1μL，25ng/μLDNA模板2μL，余量为双蒸水。

所述PCR扩增的条件为：94℃变性1min；98℃，10s，66℃，5min，30个循环；72℃延伸10min。