[发明专利]同时检测多种辣椒病毒的四重RT-PCR检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于作物病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种辣椒病毒四重RT-PCR检测引物及检测方法。

背景技术

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒属植物，为一年或有限多年生草本植物，果实通常呈圆锥形或长圆形，未成熟时呈绿色，成熟后变成鲜红色、绿色或紫色，以红色最为常见，原来的分布区在墨西哥到哥仑比亚；现在世界各地均有栽培。辣椒在我国已有数百年栽培历史，是重要的蔬菜和调味品，目前是我国大面积种植的主要蔬菜种类之一。辣椒除是一种重要的蔬菜作物外，其营养价值很高，维生素C含量在蔬菜中占首位，是番茄的7-15倍，另外辣椒中的辣椒素和二氢辣椒素是主要的辣味调味料来源，辣椒中的红色素是目前使用最为广泛的天然食品着色剂之一，同时辣椒亦具有发汗、驱虫之效。

20世纪70年代以来，由于各地品种间的交流频繁，且交流范围不断扩大，以及耕作制度等原因，我国辣椒病毒病发生范围变广，危害程度加重，严重影响了辣椒的产量和品质。杨永林等人在京、津、辽、苏、吉、新六个地区,采集辣(甜)椒病毒样本3618个采用三常规(生物、血清、电镜)鉴定手段鉴定出烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobaccoetchvirus,TEV)、苜蓿花叶病毒(AlfalfaMosaicVirus,AMV)等多种病毒。据目前报道，至少有40多种病毒可侵染辣(甜)椒，且多数国家以烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)侵染最为普遍。我国辣(甜)椒上已鉴定出的RNA病毒有17种，包括CMV、TMV、烟草蚀纹病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)、马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)、辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus，PMMoV)、苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus，AMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broadbeanwiltvirus2，BBWV2)、烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)、辣椒环斑病毒(Chilliringspotvirus，ChiRSV)、番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)、花生黄斑病毒(Groundnutyellowspotvirus，GYSV)、辣椒褪绿病毒(Capsicumchlorosisvirus，CaCV)、辣椒脉斑驳病毒(Chilliveinalmottlevirus,ChiVMV)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus，TMGMV)，今年首次在甜椒上发现的番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)以及湖南检测出的辣椒叶脉黄化病毒(Pepperveinyellowsvirus，PeVYV)，该些病毒病一般造成10％～30％的危害，严重时可减产50％～80％。

目前常用的植物病毒检测方法有生物学方法(指示植物法)、血清学方法(酶联免疫法)、电子显微镜法、反转录聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)。其中，生物学方法测定耗时长、工作量大、灵敏度较差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状，显症反应也会受到复合侵染的影响。血清学检测方法在一定范围内可能出现假阴性和假阳性的现象，且对于检测样本较小的试验来说，试剂盒的成本较高。生物学方法和血清学方法的每一次检测只能针对单种病毒，检测效率低。电镜法对于病毒科或属以下的分类不能判定，且设备昂贵，样本数量不宜过大。而RT-PCR因其特异性最强、灵敏度最高，已成为当前病原检测的首选方法，并广泛应用于植物病毒检测。对于多种病毒复合侵染，可以通过多重RT-PCR方法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，提高了检测效率，降低了检测成本，而且检测成本低，是其它检测方法所不能比拟的。但是辣椒病毒单重RT-PCR检测研究较多，而多重RT-PCR研究较少。KumarS等建立了一种双重RT-PCR能够同时检测辣椒或番茄中的TMV和ToMV两种病毒。国内外对TMV、CMV、PVY、ToMV等常见的病毒的开发出多种多重检测方法，然而国内报道的和最新发现的辣椒病毒并未发现对应的多重检测方法。