[发明专利]用于牛肉中猪肉成分定量检测的组合物、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定量检测牛肉中猪肉成分的等温数字化padlock-RCA-microscopy方法，用于所述方法的寡核苷酸探针组合物，以及包含所述组合物的padlock-RCA试剂盒。

背景技术

肉类掺假是重要的食品检验项目。目前肉类掺假的分子生物学检测技术主要采用PCR或实时荧光PCR技术。该技术的原理是根据动物特异性的基因片段序列、设计引物和探针，通过聚合酶链式反应，产生针对该特异性基因片段的信号，从而判断样品中是否含有该动物成分。这种方法在进行定量检测时，需要制备不同含量的标准样品，通过实时荧光PCR定量曲线计算样品中目标成分的含量。由于肉品加工方式多样，样品与标准样品之间的差异会带来巨大的误差。

目前的数字化PCR技术通过将样品DNA模板物理分隔，使每个微小的反应体系仅包含单个模板，通过统计大数量反应体系的扩增信号，推算样品中目标模板的比例。该技术摆脱了对标准样品的依赖，实现对样品的直接数字化检测。但该技术依赖于昂贵的数字化PCR仪和试剂盒，而且每次实验只能检测一个或少数样品。

利用滚环复制技术(RCA，rollingcircleamplification)检测靶核酸序列一般具有两种途径，一种直接扩增环形单链模板，然后检测扩增信号；另一种途径利用锁式探针(padlockprobe)，锁式探针的两端与靶核酸序列特异性互补，通过连接反应环化与模板链杂交的探针，再扩增已经环化的探针，然后检测扩增信号。

目前，国内外少见报道能同时简单、快速、特异且灵敏地检测牛肉中猪肉含量的方法。

发明内容

本申请提供了padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法，该方法采用基于padlock探针的RCA技术，设计针对猪和牛生长激素基因的特异性padlock探针，在液相环境中完成探针对生长激素基因序列的识别和成环连接，通过固定在玻片上的捕获探针捕获padlock环，利用带荧光标记的检测探针进行固相RCA滚环复制，最后在显微镜下通过检测探针的荧光标记鉴定序列。

本发明的方法在等温条件下进行，能够实现常规操作条件下的数字化检测，同时突破了实时荧光PCR方法受标准品限制，数字化PCR操作繁琐，仪器昂贵，通量低等瓶颈。

在本发明的一个方面，提供了定量检测牛肉中猪肉成分的特异性牛padlock寡核苷酸探针SEQIDNo.1(5’AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGGATGTGTTCAG3’)和特异性猪padlock寡核苷酸探针SEQIDNo.2(5’AACCTTGGGCTTTGGGGCTGCTCATAGACTAGTGCCAGATGGATGGGGCACC3’)。在所述两个序列的的5’端是磷酸基团。该padlock探针分别识别牛和猪生长激素基因的DNA序列，并使其连接成环。

在本发明的一个方面，还提供了捕获探针序列SEQIDNo.3(GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3’)。在捕获探针5’端有连接分子，例如生物素。通过该捕获探针，使连接成环的DNA序列富集在固相上，例如固定在玻片上。

在本发明的一个方面，还提供了牛检测探针序列SEQIDNo.4(5’CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3’)和猪检测探针序列SEQIDNo.5(5’CTAGTGCTGGATGATCGTCCUUUU-3’)，在所述两种检测探针的5’端连接有不同的荧光素，例如在牛检测探针的5’端标记FITC，在猪检测探针的5’端标记cy3。该检测序列对固相上的成环DNA序列进行RCA滚环复制，用于在显微镜下进行进一步的观测。

在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。

在本发明的另一个方面，提供了用于定量检测牛肉中猪肉成分的padlock-RCA试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。