[发明专利]CIK三维环境下的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种CIK三维环境下的制备方法。

背景技术

CIK(cytokine-inducedkiller，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞)是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一群异质细胞群，其中CD3+CD56+淋巴细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；诱导肿瘤细胞凋亡；通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK具有杀瘤活性高、杀瘤谱广、对正常组织毒性低、体外可高度扩增等特点，在临床细胞免疫疗法中是常用的细胞。

然而，现有的CIK制备方法是在培养瓶等2D环境下联合使用多种细胞因子诱导培养，该培养方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷。

发明内容

为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷，本发明提供一种显著增加细胞的扩增倍数，细胞活性更强的CIK的制备方法。

实现上述目的技术方案是，本发明提供的一种CIK三维环境下的制备方法，

该方法包括如下步骤，

取抑肽酶溶解纤维蛋白原，获得溶液A；

配制含有凝血酶的溶液B；

获取单个核细胞，并将所述单个核细胞与溶液A和溶液B三者混合，获得预诱导混合物；

再对所述预诱导混合物中的单个核细胞进行诱导培养，生成CIK。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*10²-10⁶个/ml，所述抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml；所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为1.5～3.5g/L；所述溶液B中凝血酶的浓度为250-400U/ml。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*10⁴个/ml，所述抑肽酶的浓度为2000KIU/ml；所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为2.0g/L；所述溶液B中凝血酶的浓度为300U/ml。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*10²个/ml，所述抑肽酶的浓度为1000KIU/ml；所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为1.5g/L；所述溶液B中凝血酶的浓度为250U/ml。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*10⁶个/ml，所述抑肽酶的浓度为3000KIU/ml；所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为3.5g/L；所述溶液B中凝血酶的浓度为400U/ml。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述溶液B由凝血酶和可溶性钙盐溶液共同配制而成。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述可溶性钙盐为CaCl₂，且CaCl₂溶液的浓度为30-50mmol/L。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，单个核细胞与溶液A和溶液B混合后置于10-40℃至凝固。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述预诱导混合物中的单个核细胞的诱导培养过程为：

将预诱导混合物置于含有抗CD3单克隆抗体和RetroNectin预包被的培养器皿中，并加入含PPP和IFN-γ的培养基进行培养；

再添加生长因子IL-1α和IL-2继续培养至单个核细胞转化成CIK。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为10-150ng/ml，RetroNectin的浓度为10-50g/ml。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述培养基中PPP的体积分数为0.5-2％，IFN-γ的浓度为500-1500IU/ml。

在本发明提供的CIK三维环境下的制备方法中，所述IL-1α在培养基中的浓度为50-150IU/ml，IL-2在培养基中的浓度为100-500IU/ml。

本发明的有益效果是：将所述单个核细胞与溶液A和溶液B三者混合，得到一个纤维蛋白凝胶状态环境，纤维蛋白凝胶能够模拟体内细胞的三维生长环境，为单个核细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，从而更有利于单个核细胞转化为CIK并能够促进CIK的生长，可显著增加CIK的扩增倍数，获得的细胞活性也更强。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：