[发明专利]pTM系列质粒载体、其构建方法以及在布鲁菌表达外源基因中的应用

权利要求书

1.pTM1-Cm质粒载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的pTM1-Cm质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

以pBBR1-MCS质粒为模板，以TM01和TM02为引物(具体序列)，PCR扩增质粒的rep序列；以pR326质粒为模板，TM03和TM04为引物，PCR扩增Cm抗性基因片段；以pCold质粒为模板，TM05和TM06为引物，PCR扩增质粒的MCS-终止子序列；胶回收以上PCR产物片段；然后，以Cm片段和MCS-终止子片段为模板，采用引物TM03和TM06为引物，进行一轮融合PCR反应，所得片段胶回收后，与PCR扩增获得rep序列共同作为模板，以TM01和TM06为引物，进行第二轮融合PCR，所得片段胶回收后，经限制性酶Nde I酶切和T4DNA连接酶进行自连接成环，构建成pTM1-Cm质粒，质粒转化至大肠杆菌DH5α进行扩增，

其中，TM01的序列5’-GGA ATT CCA TAT GGC CTG CCC CTC CCT TTT GGT G-3’如SEQID NO.6所示，

TM02的序列5’-CAT CAA GCT CTA GTT CGG TGG CGG CCG CAT AGT CTG GAA CAG CGCACT T-3’如SEQ ID NO.7所示，

TM03的序列5’-AAG TGC GCT GTT CCA GAC TAT GCG GCC GCC ACC GAA CTA GAG CTTGAT G-3’如SEQ ID NO.8所示，

TM04的序列5’-ATT TGG GTG CAA TGA GAA TGG ACG TCT AAT TCG ATG GGT TCC GAGG-3’如SEQ ID NO.9所示，

TM05的序列5’-CCT CGG AAC CCA TCG AAT TAG ACG TCC ATT CTC ATT GCA CCC AAAT-3’如SEQ ID NO.10所示，

TM06的序列5’-GAA TTC CCA TAT GGA GCT CGG TAC CCT CG-3’如SEQ ID NO.11所示。

3.持续表达质粒pGH-6×His，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，并且，所述pGH-6×His以pTM1-Cm质粒为骨架构建而成。

4.根据权利要求3所述pGH-6×His质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

以流产布鲁菌S2308基因组为模板，groE-F和groE-R为引物，PCR扩增布鲁菌groE基因的启动子区，凝胶回收片段，经Kpn I和BamHI双酶切后插入相同酶酶切过的pTM1-Cm质粒，构建成的重组质粒命名为pGH-6×His，

其中，groE-F的序列5’-GGG GTA CCC CGC TGT TCG CGC AAA AAC GCC A-3’如SEQ IDNO.20所示，

groE-R的序列5’-CGG GAT CCA TGA TGA TGA TGA TGG TGC ATG GTA TAA CCC TTGGTG TTA TAG ACG TT-3’如SEQ ID NO.21所示。

5.诱导型表达质粒pZT-6×His，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，且所述pZT-6×His以pTM1-Cm质粒为骨架构建而成。