[发明专利]pTM系列质粒载体、其构建方法以及在布鲁菌表达外源基因中的应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，本发明公开了5种质粒、质粒的构建以及在布鲁菌表达外源基因研究中的应用。本发明共包含5种质粒：pTM1‑Cm、pTM2‑Amp和pTM3‑Km是分别带有氯霉素抗性基因、氨苄霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的质粒，用于布鲁菌缺失基因的功能回补；pGH‑6×His是基于pTM1‑Cm质粒构建的、用于在布鲁菌中持续高效表达外源基因的质粒；pZT‑6×His是基于pTM1‑Cm质粒构建的、用于在布鲁菌中诱导表达外源基因的质粒。本发明系列质粒的使用将为布鲁菌基因功能研究提供重要工具。

技术领域

本发明基因工程领域，具体地说，本发明涉及到三个用于布鲁菌突变基因功能性回复研究用质粒pTM1-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km、一个用于在布鲁菌中对外源基因进行持续高效表达的质粒pGH-6×His，以及一个用于在布鲁菌中对外源基因进行四环素诱导型可控表达质粒pZT-6×His。

背景技术

布鲁菌病是一种呈世界范围流行的重要的人畜共患细菌性传染病，该病由布鲁菌属细菌感染引起^[1]。布鲁菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，感染动物主要引起孕畜流产、死胎和公畜睾丸炎；感染人类主要引起波浪热、不孕不育，或转为慢性引起关节炎等^[2]。布鲁菌感染可导致严重的发病率、重大的经济损失以及引发重要的公共卫生安全问题。该病主要呈地方性流行^[2]。布鲁菌感染的一个重要特点是细菌定植于宿主的网状内皮组织系统。不同于常规致病菌，布鲁菌没有典型的毒力因子，如外毒素、溶细胞素、荚膜、菌毛、质粒、溶源性噬菌体、药物抵抗形式、抗原变异以及内毒素特性脂多糖结构等，其毒力主要体现在入侵宿主细胞和在胞内增殖的能力^[3-5]。

目前鉴定布鲁菌未知的毒力相关因子依然是研究的热点，随着分子生物学技术的发展，各种新的高通量技术用来筛选布鲁毒力相关因子，如转座子随机突变、DNA芯片、蛋白质组学等^[6-8]。迄今已报道与布鲁菌毒力相关的基因有245个^[9]，然而，除了脂多糖、四型分泌系统、BvrS/BvrR双组份调控系统和环β-1,2-葡聚糖等外^[10-13]，大多数已报道布鲁菌毒力相关因子的功能并不十分清楚。

布鲁菌毒力因子的研究需要对靶基因进行缺失株的构建，基因的回补，基因的过量表达以及可控性表达等技术，而这些技术都是通过一系列质粒作为载体来实现的。目前用于布鲁菌基因功能研究的常用载体为pBBR1-MCS，该质粒是一种中拷贝的广宿主质粒，适合多种细菌缺失株的基因回补研究^[14_,^15]。然而，pBBR1-MCS质粒分子量大、拷贝数低，在用于靶基因的功能性互补试验、持续过量表达或可控表达研究中有所限制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供以pBBR1-MCS质粒^[14]的复制起始位点为基础，构建用于布鲁菌基因功能研究的pTM系列质粒载体。

本发明的另一目的在于提供上述系列质粒载体的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述系列质粒载体在用于布鲁菌表达外源基因中的应用。

本发明首先构建分别载有氯霉素(Cm)抗性基因、氨苄青霉素(Amp)抗性基因和卡那霉素(Km)抗性基因的三个质粒pTM1-Cm、pTM2-Amp和pTM3-Km。随后以pTM1-Cm为骨架，构建了持续表达质粒pGH-6×His以及诱导型表达质粒pZT-6×His。该系列质粒的发明将在后续布鲁菌基因功能研究中发挥重要的作用。构建5个质粒载体测序结果见序列表。

本发明pTM系列质粒中的pTM1-Cm质粒载体，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述pTM1-Cm质粒载体，以pBBR1-MCS、pR326^[16]和pCold质粒(Takara)为模板，采用如下引物对进行扩增：