[发明专利]一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用。本发明将PD1抗体与gp96蛋白联合应用，以期最大程度的减少PD1/PDL1对gp96治疗性疫苗活化T细胞的抑制作用，增强gp96蛋白的免疫活性。通过实验证明：PD1抗体大大提高了肿瘤组织来源的gp96对T细胞免疫反应的激活作用，明显抑制了肿瘤细胞的生长，并显著提高以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗对HBV复制的抑制作用，增强了乙肝治疗性疫苗的抗病毒能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种gp96蛋白和PD1抗体的偶联物的制备方法及其应用。

背景技术

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)具有独特的免疫学功能，其免疫学机制包括二方面：一是参与T细胞抗原呈递；二是有效激发天然免疫。热休克蛋白存在于细胞浆和内质网膜内，由多个成员组成，如HSP60，HSP70，HSP90和gp96等。热休克蛋白作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程中发挥重要作用，另一个重要功能是能结合细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHC I类和II类分子从而启动特异性T细胞免疫应答。

热休克蛋白本身是迄今为止发现的唯一的来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，它可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体非特异性免疫反应。有研究表明gp96对于APC中Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)发挥免疫学功能起至关重要的作用，gp96基因缺失的DC细胞中TLRs丧失引发天然免疫的功能，导致转基因小鼠抵抗感染的能力明显降低。

热休克蛋白-多肽复合物治疗性疫苗已用于临床试验。HSP治疗性疫苗治疗肿瘤的独特优势，由于肿瘤细胞是一种变异的细胞，因此外源性地给予非特异性或特异性免疫因子或细胞，增强或扩大机体的免疫力，可达到清除体内肿瘤细胞的目的。基于这个原理，多种非特异性免疫学治疗方法如给予外源性白介素2、干扰素、LAK细胞的输注等方法均已在临床使用，但疗效并不令人满意。其主要原因之一是存在肿瘤免疫逃逸。肿瘤细胞常常丢失肿瘤抗原的表达或改变其抗原表达谱，使得针对已知肿瘤抗原而设计的肿瘤疫苗不能有效激发针对肿瘤细胞的免疫反应；研究表明肿瘤具有个体特异性，肿瘤的特异性不仅表现在肿瘤类型之间，还表现在不同个体之间，即同种类型肿瘤患者中，不同个体的肿瘤生物学和免疫学特性也存在显著差别。HSP天然结合肿瘤细胞中各种抗原，因此将热休克蛋白开发成个体化肿瘤疫苗，可以充分考虑到患者个体间的差异，以达到最佳治疗效果。开展个体化治疗亦是当今医学及药物学发展的必然方向之一。

近6年来，HSP gp96-多肽复合物用于临床试验相继在美国、英国、德国、意大利及俄罗斯等国的医院或癌症中心进行，主要用于胃癌、前列腺癌、肾癌，黑色素瘤等肿瘤和HIV、生殖器泡疹等传染性疾病的治疗。目前肾癌和恶性黑色素瘤的治疗完成临床III期，直肠癌和淋巴瘤已完成临床II期。该治疗方法在俄罗斯已经批准上市。从已有的临床资料看，gp96-抗原复合物作为自体疫苗治疗肿瘤疗效无容置疑，肾细胞癌和黑色素瘤已经完成III期临床，接受治疗的患者数量大，并具有统计学意义，M1a和M1b期患者接受10次以上的免疫，平均存活期比医生选择的治疗延长18.4个月(31.2vs 12.8月，P＝0.03，危险比HR＝0.45)。对未转移肾癌患者治疗的III期临床资料发现中等风险患者(n＝362)(包括I/II期，III期的T1/2/3)接受gp96自体疫苗治疗，复发时间延长45％(P<0.01，危险比HR＝0.55)，与对照相比复发时间延长约1.8年，同时接受治疗的患者存活期延长。