[发明专利]利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物

说明书

本发明公开了一种利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物。本发明所提供的专用引物是用于检测甜瓜性别基因CmACS7和CmWIP1的成套KASP引物，其具体的核苷酸序列为序列表中序列1‑6。利用本发明所提供的基于PCR SNPLine平台的高通量分子标记系统进行甜瓜性别基因基因型的检测，操作流程全自动，降低了人为误差；分析通量高，非常适合大量样品同时检测。本发明基于甜瓜雌性花发育A/a基因和G/g基因序列设计高通量检测的分子标记，并应用于甜瓜雌性系基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速甜瓜雌性性状向优异骨干自交系的转育。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科黄瓜属甜瓜种的重要经济作物。甜瓜植株花的性型主要有以下几种表现型：雄全同株、雌雄异花同株、两性花株、雌全同株、三性混合株、全雌系(雌性系)、全雄株。目前商业栽培的甜瓜品种绝大多数为雄全同株，由于结实花是两性花，因而在杂交授粉前必须进行人工去雄、套袋、授粉、标记等操作规程，劳动强度大、制种成本高；并且人工授粉经常会伤到雌蕊，造成授粉率低，结实率下降，产量减少。如果人工去雄不彻底还会造成串粉，种子纯度难以保证。利用全株无雄花，雌花上无雄蕊的甜瓜雌性系作为母本进行杂交育种可以有效地简化制种程序、降低制种成本、提高种子纯度，因此在杂种一代的选育中，甜瓜雌性系的研究和利用显得愈来愈重要。

甜瓜性别分化主要受3个位点(a，g，gy)上等位基因的协同控制：a基因为隐性基因，控制表现雄全同株，遗传作用于大多数单性雄花，少数两性完全花；g基因为隐性基因，控制雌两性同株性状，作用于大多数单性雌花，少数两性完全花。gy为隐性基因，控制全雌株性状，与a和g互作。以上3个基因的共同作用决定了甜瓜植株的性别发育模式，其中基因型A_G_表现为雌雄异花同株，基因型A_gg表现为全雌株，基因型aaG_表现为雄全同株，基因型aagg为两性花株，基因型为A_gggygy时，形成稳定的全雌株。

Boualem等(2008)通过图位克隆获得A/a基因序列，明确了控制甜瓜性别分化雄全同株基因a为控制ACC合成酶基因CmACS7，并揭示出雄花两性花是由CmACS7基因的一个活性位点C-T突变引起。Martin等(2009)利用雌雄异花同株和全雌系的杂交群体，图位克隆得到了控制雄花向雌花过渡的基因CmWIP1(g基因)，研究发现全雌系与转座子插入引起CmWIP1基因的启动子甲基化有关。CmWIP1(g基因)和CmACS7(a基因)相互作用形成甜瓜多种性别分化类型。

由于甜瓜性型遗传背景复杂，采用传统的杂交、回交和表型选择进行雌性系育种周期长、成本高，分子标记辅助育种可以从基因型上筛选种质资源，极大地提高育种效率，目前分子标记辅助育种已经被大量应用到育种实践中，取得较好的效果。获得与甜瓜雌性系基因连锁的分子标记，特别是针对目标基因的关键突变位点开发的功能型分子标记是利用分子标记辅助甜瓜雌性性状转育，实现种质创新的前提条件。甜瓜性别决定基因的克隆使得基于目标基因序列开发功能型分子标记成为可能，Boualem等(2008)根据A/a基因序列关键突变位点开发出CAPS标记。Martin等(2009)利用G/g基因转座子插入位点设计了SCAR标记，栾非时等(2014)基于A/a基因和G/g基因的变异位点也开发出了CAPS标记和SCAR(申请号：201410039820.1，公开号103866005A)。

然而由于针对A/a基因开发的CAPS标记需要对PCR产物进行酶切，针对G/g基因设计的SCAR需要分别对G和g基因的特异片段进行扩增，再利用聚丙烯酰胺凝胶对目标片段进行分离检测等步骤，过程较为繁琐，使得这些标记在甜瓜雌性系分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测甜瓜性别基因的成套KASP引物。