[发明专利]酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法

权利要求书

1.酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，对酿酒酵母菌株糖原合成途径进行了敲除；

所述对酿酒酵母菌株糖原合成途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染色体上糖原支链酶基因GLC3来实现的。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，对所述酿酒酵母双倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤：

步骤1：设计含有GLC3基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框；

步骤2：通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中，通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条GLC3等位基因被置换的杂合子；

步骤3：将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生，收集孢子，溶解孢子子囊壁后，分离孢子；

步骤4：将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成，挑取单菌落进行PCR验证。

3.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，对所述酿酒酵母单倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤：

步骤1：设计含有GLC3基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框；

步骤2：通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中，通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。

4.如权利要求2或3所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述步骤1中设计含有GLC3基因同源臂的引物，该引物序列为：

上游引物GLC3-up：

CCCTGATAACTTCCTGTTACTATTTAAGAACACCAAACCAAGTATAAAGACAGCTGAAGCTTCGTACGC，

下游引物GLC3-down：

TATTGAGTCTTGATTTTCAGTAAGCAATATAGTATAGAGTTCATTCTTTTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG。

5.如权利要求2或3所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述步骤2中通过G418平板筛选以及PCR验证，该PCR验证的引物序列为：

上游引物GLC3-A：5’-CCCTGATAACTTCCTGTTAC-3’

下游引物GLC3-D：5’-GAGTCTTGATTTTCAGTAAG-3’。

6.如权利要求2所述的提高酿酒酵母菌株生产S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，所述步骤3中溶解孢子子囊壁后，分离孢子，具体为：400微升孢子悬浮液中加入10微升蜗牛酶溶液，37℃下水浴3h，然后用100w超声振荡处理5s，间歇7s，振荡5个周期；显微镜下确认孢子充分分离。

7.酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，将糖原支链酶基因GLC3基因敲除的酿酒酵母菌株进行发酵罐分批补料发酵生产SAM。

8.如权利要求7所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，该发酵培养基成分具体为：10g/L葡萄糖,3g/L酵母粉,5g/L硫酸铵,10g/L磷酸二氢钾,3g/L硫酸镁,0.1g/L七水硫酸锰,0.6g/L七水硫酸锌,0.55g/L硫酸亚铁,0.5g/L氯化钠,0.5g/L氯化钙,1.6mg/L硫酸铜,4.84mg/L钼酸铵,0.3mg/L生物素,3.6mg/L泛酸钙,3.6mg/L微生物B₁,3.6mg/L维生素B₆。