[发明专利]酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种酿酒酵母基因工程改造提高S‑腺苷‑L‑蛋氨酸产量的方法，先利用一步基因置换法将酿酒酵母菌株染色体上一条GLC3（糖原支链酶基因）等位基因替换成G418抗性基因，然后通过孢子分离方法得到只含有GLC3基因被替换的单倍体，从而得到GLC3基因突变了的纯合子。通过10L和500L发酵罐发酵验证，突变菌株生产腺苷蛋氨酸产量分别达到了7.93g/L和8.35g/L，比原始菌株提高了15.1%和24.7%。

技术领域

本发明属于微生物技术、代谢工程领域，涉及一种通过代谢途径改造来提高酿酒酵母菌株生产S-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。

背景技术

S-腺苷-L-蛋氨酸，简称SAM，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，是一种重要的代谢中间产物。作为胞内甲基供体，SAM在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中扮演重要角色。同时，SAM还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。SAM也是一种非常有价值的医药分子，在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。

SAM在胞内是经过腺苷蛋氨酸合成酶催化，由蛋氨酸和三磷酸腺苷（ATP）结合生成的。研究标明，胞质内过量的SAM对细胞毒害作用非常强，SAM不能在细胞液中大量贮存。然而，酵母一类微生物却能在富含蛋氨酸的环境中大量合成并积累SAM，这是因为酵母细胞的液泡中含有大量的带负电荷的聚磷酸盐，这些聚磷酸盐能固定住带正电荷的SAM。因此，酵母成为了工业生产SAM的首选宿主。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有遗传背景清楚、食品级安全、抗逆性强以及发酵条件容易控制等许多优良特性，因此被广泛用作食品、医药以及化工工业的生产菌株。尽管天然的酿酒酵母生产腺苷蛋氨酸能力已经很强，但还是不能满足市场日益增长的需求，寻求更多途径继续提高腺苷蛋氨酸的产量的任务迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为满足腺苷蛋氨酸日益增长的工业生产需求，提供一种酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法。为此，针对工业中经常采用的双倍体菌株，本发明采用以下技术方案：

酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，对酿酒酵母菌株糖原合成途径进行了敲除。

进一步地，所述对酿酒酵母菌株糖原合成途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染色体上糖原支链酶基因GLC3来实现的。

进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，对所述酿酒酵母双倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤：

步骤1：设计含有GLC3基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框；

步骤2：通过醋酸锂（LiAC）转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中，通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条GLC3等位基因被置换的杂合子；

步骤3：将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生，收集孢子，溶解孢子子囊壁后，分离孢子；

步骤4：将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成，挑取单菌落进行PCR验证。

进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，对所述酿酒酵母单倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤：

步骤1：设计含有GLC3基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框；

步骤2：通过醋酸锂（LiAC）转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中，通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。

进一步地，所述步骤1中设计含有GLC3基因同源臂的引物，该引物序列为：

上游引物GLC3-up：