[发明专利]一种半夏试管微球茎的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养方法，尤其是一种半夏试管微球茎的制备方法。

背景技术

半夏是天南星科植物半夏［Pinelliaternata（Thunb.）Breit.］的块茎，始载于《神农本草经》，为我国传统的常用中药材，也是贵州著名地道药材。半夏性温，味辛，有小毒，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，用于痰多咳喘、呕吐反胃、胸腕痞满、梅核气、痈肿痰核等多种病症。目前，由于贵州地区多年来长期种植半夏，随之半夏种源病毒逐渐增多，种源退化、病害等现象日益凸显，导致半夏产量降低。虽然将组织培养技术成功用于半夏良种繁育及其试管苗移栽已有不少报道，然而半夏试管苗移栽工作量极大、成本高、没有推广应用价值的问题，加之半夏田问生产实行高密度种植，需要栽种25000～30000株／667m2试管苗，移栽和栽后管理工作量极大，成本高，因而该技术在半夏药材规模化人工种植中几乎没有推广应用的价值。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明旨在提供一种高效生产半夏试管微球茎的方法，本发明中半夏试管微球茎是指在组织培养条件下，以半夏块茎经过诱导出愈伤组织，脱去主要病毒，再用愈伤组织诱导出半夏组培芽，通过控制培养基成分和培养条件及环境温度，诱导试管苗形成微球茎，主要解决半夏繁殖速度和退化问题。

本发明采用的技术方案：一种试管微球茎的制备方法，包括如下操作步骤：

1.将半夏块茎接入培养基中诱导出愈伤组织后，进行继代增殖、芽的分化；

2.当经过诱导出的半夏组培芽长到有1～3cm长时，选取生长良好的芽，从愈伤组织处切下，使其带有一块愈伤组织，愈伤组织直径3±1mm，将半夏组培芽接入到诱导培养基中，芽留在培养基外面，诱导培养基的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.8mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.8mg/L、糖浓度为3%，诱导培养基的肌醇浓度提高到500mg/L，放入光照条件12h/d，光照时间为12h/d，温度为23—27℃左右的培养室中培养；

3.将带有愈伤组织的幼芽接入到培养基中后，在前10d愈伤组织继续增大，幼芽也迅速增长，在10—20d中从愈伤组织上不断长出不定根，且愈伤组织不在增殖，表面变得平滑，有绿色的亮泽出现，在20—30d中植株不断成熟，同时，愈伤组织完全变成与半夏块茎外形、结构相似的幼小球茎；

4、将诱导出与半夏块茎外形相似的幼小球茎从培养基中取出洗净，将微球茎以上的半夏苗切除，保留球茎部分，并将获取的半夏微球放入到质量浓度为0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5—8min，然后放入到活性炭:滑石粉:多菌灵比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.1mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.1mg/L、赤霉素GA3浓度为0.1mg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤2操作，放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5—7min取出置于空气中固化10-15min，再将已固化的半夏微球放入0.4%氯化钙溶液中侵泡1-2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装、贮藏。

上述方法繁殖速度快，生产效率高，生产成本低，能周年工厂化生产；生产出来的试管微球茎具有无病毒、体积小、贮藏运输方便特点，是一项具有产业前景，能从根本上解决半夏退化的先进方法。

具体实施方式

施秉县中药材种苗繁育组培室。

1.材料

1.1原材料

以天南星科半夏［Pinelliaternata（Thunb.）Breit.］块茎作为半夏愈伤组织的诱导材料，经继代培养分化成芽，再将分化出的芽作为微球茎诱导的材料。

2.愈伤组织的制备方法

2.1外植体的选择和预处理

在半夏出苗到倒苗期间，挖取长势较好的半夏块茎，反复用自来水冲洗30～40min，以冲洗掉表面的泥土，并去掉块茎表皮，然后进行灭菌处理。

2.2灭菌处理

在无菌操作台上，先用75%酒精消毒30s后，用无菌水冲洗2min，至少2次，再把外植体放入0.1%的HgCl2溶液中灭菌8min，然后用无菌水冲洗6～8min，至少冲洗5次，每一步都要不停的摇动，使材料、消毒液与无菌水充分接触，目的是提高消毒效果以及让无菌水更好的去除残留的消毒剂，降低消毒剂对材料的毒害作用。

2.3培养基的配制