[发明专利]一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及其离体再生培养基

说明书

本发明公开了一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及其离体再生培养基。本发明以皇帝蕉雄花薄片为外植体，采用离体再生培养基诱导获得不定芽，将不定芽的切片作为转化受体，通过基因枪和农杆菌介导法相结合的方法将T‑DNA插入到皇帝蕉基因组中，得到转基因皇帝蕉。通过试验证明：与单独基因枪法转化和单独农杆菌介导法相比，本发明的方法转化效率高且转化周期短。本发明建立了适合皇帝蕉的高效遗传转化体系，为通过生物技术手段培育皇帝蕉新品种奠定了基础，更为今后皇帝蕉乃至其它香蕉基因功能的鉴定及转基因新品种的培育提供技术支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及其离体再生培养基。

背景技术

皇帝蕉(Musa acuminata cv.Mas)属单子叶植物纲、芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)植物，原产印度尼西亚，印尼称其为Pisanmas，是独特的食用二倍体(AA型)蕉。20世纪50年代末由华侨李木清从印尼引进我国海南省兴隆种植。皇帝蕉又称贡蕉、帝王蕉、米香蕉、金香蕉等，抗病能力较强，果实小巧美观、饱满、皮薄、含多种维生素，备受消费者青睐，是世界上公认的高档香蕉品种之一(魏岳荣，2005；王丽萍，2014)，但与普通香蕉相比，皇帝蕉产量较低，肉质较硬，偏酸，因此其产量和品质风味等均有待进一步提高。

皇帝蕉虽然是二倍体，但是无籽，具有高度不育性，因此很难用传统育种方法培育生产实践中所需要的新品种。转基因技术的发展为皇帝蕉育种提供了一种行之有效的手段。转基因育种成功与否取决于高效离体再生体系和遗传转化体系的建立。2005年，魏岳荣等以皇帝蕉未成熟雄花序的第1～15位花梳为外植体，建立和优化了胚性细胞悬浮系。虽然胚性细胞悬浮系被认为是转基因理想的受体材料，但是诱导和保持皇帝蕉胚性细胞悬浮系非常困难，胚性愈伤发生率低，胚性细胞再生率低，再生周期长，从胚性愈伤分化成苗相当困难。这些一直都是制约皇帝蕉转基因研究的瓶颈因素。目前较常用的遗传转化方法有农杆菌介导法和基因枪法，这些方法在其它香蕉品种如巴西香蕉上有遗传转化取得成功的报道(胡春华等，2010a；2010b；2014；Yip et al.,2011；Ghag et al.,2012；Kov cs et al.,2013；Vishnevetsky et al.,2011)，然而香蕉遗传转化对品种的依赖性非常强，而且香蕉是单子叶植物，不是农杆菌的理想宿主，已有报道都是采用单独一种方法进行转化且转化效率较低，关于皇帝蕉转化成功的报道仅有一例，是采用农杆菌介导法转化胚性细胞悬浮系(Huang et al.,2007)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种离体再生培养基。

本发明提供的离体再生培养基是将6－苄基嘌呤、1-苯基-3-(1，2，3，-噻二唑-5-基)脲、蔗糖、凝固剂与液体MS培养基混匀得到的。

上述离体再生培养基中，所述6－苄基嘌呤在所述离体再生培养基中的浓度为0.5-2.5mg/L；

所述1-苯基-3-(1，2，3，-噻二唑-5-基)脲在所述离体再生培养基中的浓度为0.5-2.5mg/L；

所述蔗糖在所述离体再生培养基中的浓度为35-40g/L；

所述凝固剂在所述离体再生培养基中的浓度为6.8-7.5g/L。

上述离体再生培养基中，所述凝固剂为琼脂；

所述6－苄基嘌呤在所述离体再生培养基中的浓度为2mg/L；

所述1-苯基-3-(1，2，3，-噻二唑-5-基)脲在所述离体再生培养基中的浓度为2mg/L；

所述蔗糖在所述离体再生培养基中的浓度为40g/L；

所述琼脂在所述离体再生培养基中的浓度为7g/L。

本发明的另一个目的是提供上述离体再生培养基的新用途。