[发明专利]一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法

权利要求书

1.一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球，其特征在于：其酶活性为25-35U/mg。

2.根据权利要求1所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球，其特征在于：其在pH6.5～8.0之间的稳定性能保持在75％以上，储藏时间在30天内固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的酶活性为80％以上。

3.一种如权利要求1或2所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：

(1)磁性壳聚糖微球的偶联：将绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于pH3～9的缓冲液中得到蛋白酶缓冲液，再将其加入到经过活化的磁性壳聚糖微球中，水浴振荡偶联2～14h，振荡温度为30-60℃，得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球；

(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：再将偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球加入蚯蚓纤溶酶粗酶溶液在30-60℃恒温水浴摇床中振荡固化反应0.5-3h；反应结束后，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。

4.根据权利要求3所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中蛋白酶缓冲液与活化的磁性壳聚糖微球的液固比为5～30∶1，水浴振荡偶联4～6h。

5.根据权利要求3所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的缓冲液为柠檬酸钠-磷酸氢二钠缓冲液。

6.根据权利要求3所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，每克偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球则加入1～5ml酶活为1-2万U/mL的蚯蚓纤溶酶粗酶溶液。

7.根据权利要求3所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述活化的磁性壳聚糖微球的制备是将磁性壳聚糖微球，加入NaOH溶液和NaBH₄溶液，在30～80℃水浴振荡30～40min，再加入二甲基亚砜为活化剂，再加入体积分数为10％～60％的环氧氯丙烷，振荡活化2～10h后，抽滤，用蒸馏水洗涤即可得到活化的磁性壳聚糖微球。

8.根据权利要求7所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述磁性壳聚糖微球与NaOH溶液的重量比为1∶5～10，磁性壳聚糖微球与NaBH₄溶液的重量比为1∶4～12；每克磁性壳聚糖微球加体积分数为40％～60％的二甲基亚砜1.5～9mL，环氧氯丙烷为1～12mL。

9.根据权利要求7所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述NaOH溶液的浓度为1.2～2.0mol/L，NaBH₄溶液的浓度为5～10g/L，环氧氯丙烷的体积分数为30％～50％，在30～60℃下振荡活化2～6h。

10.根据权利要求7或9任一所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述磁性壳聚糖微球的制备方法：

(1)将液体石蜡和Span-80按照重量比为30～50∶1混合，在30～50℃搅拌1～2h制备成油相；

(2)称取一定量的壳聚糖，用3～5％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后得到浓度为5～10mg/mL的壳聚糖溶液，加入Fe₃O₄粉末，超声分散10～20min，制得到水相；

(3)将水相与油相按照体积比为1∶5～6，将水相缓慢加入油相中，搅拌0.5～1h使溶液形成乳液体系；

(4)再向乳液体系中滴加质量分数为25％的戊二醛，继续搅拌1～2h，用NaOH溶液调pH至9～10，继续反应1～2h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤至中性，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。