[发明专利]一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于磁性微球技术领域，具体是涉及用于固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法。

背景技术

磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性，所以不仅能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基(如-OH、-COOH、-CHO、-NH₂，等)，还能在外加磁场作用下具有导向功能。磁性微球在固定化酶、细胞分离、蛋白质分离和纯化、免疫测定、靶向药物和DNA分离与核酸杂交等领域有着广泛的应用前景。目前常用于制备磁性微球的方法有包埋法、悬浮聚合法，这些方法制备得到的磁性微球粒径分布较宽，形状不规则。

绿豆胰蛋白酶抑制剂属于Bowman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂，含有7对二硫键，72个氨基酸残基，分子量为7.98kD，具有2个同源的结构域。抑制活性由活性中心及附近的氨基酸残基决定，绿豆胰蛋白酶抑制剂含有两个活性中心，分别为Lys20-Ser21和Arg47-Ser48，这两个活性片段可被消化酶消化分离，并都具有胰蛋白酶抑制活性，其中Arg活性片段有27个氨基酸残基组成，而Lys活性片段有两个肽链组成，由26个氨基酸残基组成的长链和9个氨基酸残基组成的短链，它们分别由分子内二硫键形成环状，绿豆胰蛋白酶抑制剂对热、酸、碱的稳定性很高。绿豆中含有的胰蛋白酶抑制剂的比活力是大豆胰蛋白酶抑制剂的2.76倍。

蚯蚓纤溶酶又称蚓激酶，是从蚯蚓体内提取出来的既具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性的一类蛋白质，既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成，实验表明该酶具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质，是预防和治疗血栓疾病的有效药物，该酶属于丝氨酸蛋白酶，可被丝氨酸蛋白酶抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂抑制，近几年的临床应用表明，它在治疗脑血栓、半身不遂、心肌梗塞等血栓类疾病方面具有见效快、疗效良好、口服有效、且较安全等优点。大量研究表明蚯蚓纤溶酶无论静脉注射或口服给药，均具有溶栓作用，是一种目前较为理想的血栓病治疗药物，具有广阔的开发前景。通常纤溶酶的提取是通过蚯蚓匀浆、盐析、凝胶层析、离子交换层析及高效液相色谱(HPLC)等一系列步骤进行分离纯化得到，该方法提取得到的纤溶酶纯度高，但由于纯化工序复杂成本高，耗时长经济效益低，只能用于实验室研究，很难用于工业生产，如何得到稳定的高活性的蚯蚓纤溶酶，可以为蚯蚓资源的利用开辟一条道路。

目前还没有关于绿豆胰蛋白酶抑制剂偶联壳聚糖磁性微球用于固定化蚯蚓纤溶酶的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法。其以绿豆胰蛋白酶抑制剂为配基，与磁性微球偶联，运用用于蚯蚓纤溶酶的分离纯化，提高了蚯蚓纤溶酶的分离纯化选择性，而且磁性微球易于与蚯蚓纤溶酶分离。

本发明的技术方案如下：

一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球，其酶活性为25-35U/mg，在pH6.5～8.0之间的稳定性能保持在75％以上，储藏时间在30天内固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的酶活性为80％以上。

本发明的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：

(1)磁性壳聚糖微球的偶联：将绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于pH3～9的缓冲液中得到蛋白酶缓冲液，再将其加入到经过活化的磁性壳聚糖微球中，水浴振荡偶联2～14h，振荡温度40～60℃，后得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球；

(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：再将偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球加入蚯蚓纤溶酶粗酶溶液在30-60℃恒温水浴摇床中振荡固化反应0.5-3h；反应结束后，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。

作为技术方案的优选，所述步骤(1)中的缓冲液为柠檬酸-磷酸二氢钠。所述蛋白酶缓冲液与活化的磁性壳聚糖微球的液固比为5～30∶1，水浴振荡偶联4～6h。这个工艺条件得到的偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球性能特别好。

作为技术方案的优选，所述步骤(2)中，每克偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球则加入1～5ml酶活为1-2万U/mL的蚯蚓纤溶酶粗酶溶液。