[发明专利]高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建

权利要求书

1.一种生物合成生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。其特征在于，通过敲除基因sucA(编码α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1亚基，及α-酮戊二酸脱羧酶)打断TCA循环中由α-酮戊二酸到琥珀酸的过程，转化含有色氨酸串联启动子(Ptrp2)、反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因(hyp)、透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pUC19-Ptrp2-hyp—vgb(之后简称pUHVT4)。L-脯氨酸在羟化酶的催化作用下，以α-酮戊二酸为共同底物，生成反式-4-羟脯氨酸，同时生成琥珀酸。利用该反应过程的特点，由羟化酶取代α-酮戊二酸脱氢酶的作用，在脯氨酸羟基化的同时又不影响TCA循环的正常进行。

2.根据权利要求1所述的一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的生物合成方法，其特征在于：通过敲除基因sucA，打断TCA循环中由α-酮戊二酸到琥珀酸的过程，由脯氨酸羟基化的过程来“回补”该过程，此方法具有稳定性。

3.根据权利要求1所述的基因敲除不局限于sucA单敲除，包括其他功能相同的基因的单敲除或双敲除，如sucB、sucC、sucD、sucAB、sucCD。

4.根据权利要求1所述的基础菌不局限于putA缺失菌，包括其他的任何有利于L-脯氨酸羟脯氨酸积累的菌株。

5.根据权利要求1所述的阻断或减弱微生物代谢途径的方法包括:基因敲除、基因定点突变、RNA干扰、加大其他途径的关键酶的表达量等。

6.根据权利要求1所述的启动子不局限于色氨酸串联启动子，包括其他任何可以有效调控基因表达的启动子：如tac启动子、T7启动子、lac乳糖启动子、λ噬菌体转录启动子PL与PR等。

7.根据权利要求1所述的菌种不限于大肠杆菌BL21(DE3)，包括其他的任何能够将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌属。