[发明专利]高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建

说明书

技术领域

本发明涉及高产反式-4-羟脯氨酸菌株的构建，简单的说就是利用基因敲除和途径取代的方法与理论来构建菌株，属于基因工程领域。

背景技术

反式-4-羟脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-ProLine)，又名L-羟脯氨酸，是胶原蛋白的主要组成成分。羟脯氨酸在很多领域具有重要的应用价值，如医药、食品、生化以及美容行业等领域。如在医药方面，反式-4-羟脯氨酸是很多化学品合成的手性合成子，如消炎药、碳青霉烯类、血管紧张肽转化酶抑制剂、抗高血压药物等，此外，由于其具有多种生理功能和较为独特的生物活性，可作为治疗如风湿性关节炎、结缔组织受损等软组织疾病的药物。在食品中的作用，如利用其呈苦味中的独特甜味的性质，可用于改善果汁的风味。在美容业，作为化妆品添加剂，可起到抗氧化、抗辐射、保湿的作用，用于保养皮肤和延缓衰老。

最初，羟脯氨酸是通过动物胶原蛋白的水解获得的，但该过程存在复杂、耗时、废弃物过多的缺点。之后也有关于用微生物产羟脯氨酸的报导，但那些方法存在低产率、高成本的问题，很难用于工业生产。故需要进一步改进生产菌株，优化生产工艺，降低生产成本，提高生产得率。

本实验室已有的研究结果包括以下几个部分。根据密码子的简并性与大肠杆菌对密码子的偏好性，优化反式-4-羟化酶基因(hyp)。通过改变同义密码子调整该基因的mRNA的5’端，使其呈开放结构，以提高mRNA的翻译效率，使其能在大肠杆菌中得到更好的表达。同时，选用组成型启动子——色氨酸串联启动子(Ptrp2)来控制羟化酶基因的表达。该启动子的特点就是不需要诱导剂的诱导，有利于羟脯氨酸后续的纯化。在实验室已有质粒的基础上，优化表达载体，最终选用全细胞酶活最高的质粒——pUC19-Ptrp2-hyp作为最适表达载体。之后，敲除基因putA，以打断L-脯氨酸向L-谷氨酸的降解途径，使得更多的L-脯氨酸进入反式-4-羟脯氨酸的生产途径。引入vgb基因，解决菌株生长过程中的溶氧过低的问题，进一步提高发酵产量。

发明内容

考虑到L-脯氨酸在生成反式-4-羟脯氨酸的过程中，有α-酮戊二酸、氧分子以及亚铁离子(Fe²⁺)作为底物，产物中有琥珀酸、CO₂。而α-酮戊二酸生成琥珀酸是TCA循环过程中一个步骤，因此，考虑用L-脯氨酸的羟基化过程来取代TCA循环中的该过程，既保证菌株的正常生长，又可以得到羟脯氨酸。

本发明技术内容如下：

(1)构建含有打靶片段——sucA上下游同源臂、羟化酶基因以及抗性筛选基因Kan的载体pET21a-sucA’-Kan-hyp(pET21AKH)。

(2)在大肠杆菌BL21(DE3)ΔputA的基础上，敲除sucA基因。

(3)转入质粒pUHVT4，之后进行发酵条件的优化与验证。

附图说明：

图1实验思路与基本理论图。

图2含有打靶片段的质粒pET21AKH的图谱。

图3表达质粒pUHVT4图谱。

具体实施方式

(1)实验中涉及的主要试剂配制

LB培养基：1g/L胰蛋白胨，1g/L氯化钠，1g/L酵母提取物(YeastExtract)。其中固体培养基：加入1.5％-2％的琼脂粉。

各种抗性平板：在(1)中的已灭菌的固体培养基的基础上，添加抗生素。配制浓度为50mg/mL的抗生素母液，过滤除菌后-20℃保存。待灭菌后的固体培养基冷却至60℃左右时，加入抗生素母液(稀释1000倍)。其中，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素的终浓度均为50μg/mL。

发酵培养基：葡萄糖8g/L，甘油10g/L，硫酸铵13g/L，玉米浆8g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化钠2g/L，氯化钙0.015g/L，硫酸镁0.3g/L，亚铁离子4mM，初始L-脯氨酸100mM。

柠檬酸缓冲液：50g柠檬酸，26.3gNaOH，146.1g结晶乙酸钠，溶于1L的水中，之后加入200mL水和300mL的正丙醇，混匀。

氯胺T试剂：1.41g氯胺T，溶于10ml的水中，之后加入10mL的正丙醇和80mL的柠檬酸缓冲液，混匀。

显色剂：5g对二甲基苯甲醛，溶于17.5mL的高氯酸中，待溶解后缓缓加入32.5mL的异丙酮，混匀。

(2)相关的测量方法及比色法的原理