[发明专利]一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒

权利要求书

1.一种去除A47L基因从而降低自身免疫优势的重组WR株痘苗病毒。

2.一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，利用病毒体外重组，以OVA取代A47L，获得A47L基因缺失的重组痘苗病毒，包括如下步骤：

S1、构建质粒pSC11A47L-OVA；

S2、在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组；

S3、通过多轮筛选获得重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)。

3.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，在质粒pSC11中插入A47L左右侧同源序列(分别为A47LL和A47LR)及OVA，抗性筛选标记为氨苄青霉素抗性基因，同时包含重组病毒筛选标记LacZ基因。

4.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤如下：以野生型痘苗病毒的基因组DNA为模板，通过PCR获得A47L左右侧同源片段，通过酶切和连接的方法，以A47LL替代质粒pSC11的TKL片段，A47LR替代质粒pSC11的TKR片段，以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板，通过PCR获得有合适酶切位点的OVA基因片段，通过酶切和连接的方法将OVA片段插在P7.5启动子之后。

5.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，利用质粒pSC11A47L-OVA对野生型痘苗病毒进行体外重组，最终以OVA取代病毒中的A47L。

6.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤如下：培养CV-1细胞至80％单层时，以0.05MOI感染野生型痘苗病毒病毒并使用Lipofectamine2000转染pSC11A47L-OVA质粒至感染细胞中，48小时后，收集病毒。

7.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，利用蓝斑筛选和密度梯度离心纯化重组病毒。

8.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤如下：取步骤S2收集的病毒冻融三次并超声破碎后感染CV-1细胞，并覆盖琼脂培养基；2天后，加入含有300μg/mLX-gal的上层培养基。挑取孤立蓝斑病毒。重复以上步骤单斑纯化5代，鉴定无误后，使用CV-1细胞进行重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)的体外增殖。将收获的病毒反复冻融三次，超声破碎后采用密度梯度离心纯化病毒，分装保存于-80℃。