[发明专利]一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程及免疫领域，具体涉及一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒。

背景技术

痘苗病毒是一种大分子DNA病毒，是人类消灭天花的主要疫苗，能够引起强烈的免疫反应和超长的免疫记忆。由于活痘苗病毒作为疫苗在天花免疫中的成功应用，痘苗病毒被当做衡量一个疫苗有效与否的“金标准”，受到广泛的重视。

现阶段世界上多个以痘苗病毒为载体的，旨在预防感染性疾病以及肿瘤的重组疫苗已经进入临床测试阶段，但其中的多数均未能达到理想的免疫效果。一个重要的原因就是，在重组疫苗引发的免疫应答中，针对载体本身的反应牢固地占据着优势地位，并显著地抑制了外源性目的抗原的免疫原性，即疫苗载体的免疫优势效应。痘苗病毒自身的一些表位，尤其是一些优势表位(dominantepitope)如B8R、A47L、K3L等的存在，能够在很大程度上影响宿主针对外源抗原的免疫应答。在保持痘苗病毒感染和复制能力的前提下，去除病毒本身的一些优势表位，从而降低载体本身对外源性目的抗原的限制作用，对于提高重组疫苗的有效性势必具有非常重要的作用。

A47L是痘苗病毒上的一种重要的D^b限制性的杀伤性T细胞表位。A47L位于痘苗病毒基因组的右侧末端，在正痘病毒中高度保守，而在其他非正痘病毒中缺乏相似序列。A47L在痘苗病毒感染中高转录高表达，但其功能在痘苗病毒生长和复制过程中是非必需的。

发明内容

为降低作为疫苗载体的痘苗病毒的免疫优势，提高重组痘苗病毒疫苗的安全性和有效性，本发明提供了一种重组痘苗病毒的方法，以痘苗病毒WesternReserve株为骨架，在去除A47L基因的同时插入卵清蛋白(OVA)基因，构建表达OVA的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA，此为本发明的目的。去除痘苗病毒的优势表位A47L对外源抗原免疫原性的抑制，可有效降低痘苗病毒自身的免疫优势，增加外源性抗原(如OVA)的免疫原性。本发明生成的A47L基因缺失的重组痘苗病毒(VACV-ΔA47L)，可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体，此为本发明的另一目的。

本发明所述的重组痘苗病毒，是将野生痘苗病毒的A47L基因替换为带有LacZ标记的OVA基因得到的重组痘苗病毒。

在本发明的实例中，所述野生痘苗病毒为野生型WR株痘苗病毒，所述的野生型WR株痘苗病毒的基因组DNA序列为GenBank号为AY243312.1的序列(VRL14-MAR-2006)。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种重组痘苗病毒的构建方法，包括如下步骤：

S1、构建质粒pSC11A47L-OVA；

S2、pSC11A47L-OVA在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组；

S3、筛选纯化获得重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)。

其中，所述步骤S1的具体步骤如下：

S11、取冻存的野生型痘苗病毒和本实验室构建的VACV-OVA病毒，使用Biomiga病毒基因组提取试剂盒，提取基因组DNA；

S12、根据野生型痘苗病毒的A47L基因及其上下游序列，设计引物，以野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，PCR获得A47L基因的上下游同源序列臂A47LL如A47LR。

S13、将获得的上下游同源臂A47LL和A47LR通过酶切和连接的方法分别替代pSC11质粒的TKL和TKR，获得中间质粒pSCA47L。

S14、根据GenBank中OVA基因序列，设计引物，以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板，通过PCR获得OVA基因，将获得的OVA基因插入中间质粒pSCA47L的P7.5启动子之后，得到痘苗病毒重组工具穿梭质粒pSCA47L-OVA。

其中，所述步骤S2的具体步骤如下：

待培养的CV-1细胞至80％单层时，以0.05MOI感染野生型痘苗病毒并使用Lipofectamine2000转染pSC11A47L-OVA质粒至感染细胞中，48小时后，收集病毒。

其中，所述步骤S3的具体步骤如下：

取上述收集的病毒反复冻融三次，超声破碎后感染新的CV-1细胞，并覆盖琼脂培养基；2天后，加入含有300μg/mLX-gaI的上层培养基筛选重组病毒。挑取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代。经PCR、基因测序和WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后，进行重组病毒的体外增殖，并将最终收获的病毒采用密度梯度离心纯化，保存于-80℃。

本发明具有以下有益效果：