[发明专利]一种盐穗木金属硫蛋白发酵工艺及其应用

说明书

本发明提供一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺及其应用，将现有技术中重组表达转化体在37℃培养过夜，以2%的比例接种到改良后的发酵培养基，在全自动发酵罐进行发酵，装液系数0.5，添加消泡剂后整体灭菌，通气量为1 L/min，保持温度37℃、搅拌转速100r/min，发酵4 h后加入浓度为6mmol/L乳糖进行诱导，继续发酵4h后将发酵液以8000rpm离心10min得到菌体，再用PBS洗涤离心三次，105℃干燥1.5h后恒重称量盐穗木金属硫蛋白的菌体干重，所得菌体量比摇瓶培养提高了31%，本发明能够大幅度提高盐穗木金属硫蛋白的产量，并适于工业化大规模生产，对金属硫蛋白应用领域具有广泛意义。

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体的，本发明涉及盐穗木金属硫蛋白发酵工艺及其应用的技术领域。

背景技术

金属硫蛋白（Metallothionein, MT）是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。1957年Margoshes和Valles在研究镉的生物学作用时，从蓄积镉的马肾中首次分离出该物质。MT具有以下几个特征：分子量低，一般为 6~7kD；能螯合金属离子，蛋白通过硫酯键与金属结合后, 具有特殊的光吸收特征；半胱氨酸含量高，约占氨基酸残基总数的23%~33% ，但不形成二硫键，分子中缺乏芳香族氨基酸和组氨酸；半胱氨酸残基在氨基酸序列中具有较为保守的排列方式。金属硫蛋白丰富的巯基含量及重金属结合能力决定了其功能的多样性。

盐穗木（Halostachys caspica）为藜科盐穗木属，是生长在荒漠、半荒漠盐碱地上的重要盐生、旱生稀盐多汁半灌木植物，对盐分适应性极强，是盐土荒漠主要植物之一。在高盐和重金属胁迫下，其体内的金属硫蛋白基因表达水平呈明显上升趋势。目前国内生产MT的厂家，主要从兔肝中提取，由于MT原料需求特别，且生产工艺复杂，导致目前MT产量不大且价格昂贵。现有文献已经披露了一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用（刘忠渊，专利申请号：2013105667426），现有技术公开了一种仅适用于实验室小规模制备盐穗木金属硫蛋白的方法，实验室制备盐穗木金属硫蛋白具有成本高、提取率低等限制因素，且现有文献中并未披露一种适于工业化生产盐穗木金属硫蛋白的技术方案，随着盐穗木金属硫蛋白产品的用途不断扩大、用量不断增加，国内外盐穗木金属硫蛋白的产量远远不能满足市场实际需求，所以急需一种高产量、低成本、安全性高、适宜于工业化生产盐穗木金属硫蛋白的工艺方法。

发明内容

针对现有技术中未见有关工业化生产盐穗木金属硫蛋白的方法的研究现状, 本发明目的旨在于提供一种盐穗木金属硫蛋白发酵工艺及其应用，通过条件优化得到改良后的发酵培养基，采用发酵罐放大生产，从而提高盐穗木金属硫蛋白产量，克服了目前盐穗木金属硫蛋白制备领域中高成本低产量的现状。本发明改变了传统金属硫蛋白的生产方法，通过使用本发明的盐穗木金属硫蛋白发酵工艺，可大幅度提高盐穗木金属硫蛋白的产量，适于工业化生产。

本发明为实现以上技术目的，提供一种盐穗木金属硫蛋白的发酵工艺及其应用，具体发酵步骤如下：

将现有技术中获得的重组表达转化体在37℃培养过夜，再以2%的比例接种到改良后的发酵培养基，在全自动发酵罐进行发酵，装液系数为0.5，添加消泡剂后整体灭菌，通气量设为1 L/min，保持温度37℃、搅拌转速100r/min，发酵4 h后，加入浓度为6mmol/L乳糖进行诱导，继续发酵4h后，将发酵液以8000rpm离心10min得到菌体，再用PBS洗涤离心三次，105℃干燥1.5h后恒重称量制备获得盐穗木金属硫蛋白的菌体干重。