[发明专利]硫酸软骨素ABC酶融合蛋白制备方法及其应用

权利要求书

1.一种制备硫酸软骨素ABC酶融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：

1)克隆并连接硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因，分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白基因，并连接上述基因，使得后续表达的3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接；

2)获得含有所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因的重组表达载体，将所述步骤1)连接的硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因重组到表达载体；

3)表达所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白，将所述步骤2)中克隆的含有硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因的表达载体转化到宿主细胞中，进行表达；以及

4)收获并纯化表达的所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤1)中硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)中表达硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因的表达载体包括pMAL-c2x。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤3)中表达所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白的宿主细胞包括E.coli JM109和DH5α；

其中，所述步骤3)中表达所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白条件为TB培养基37℃培养3小时，加入终浓度为0.5mM IPTG，10-42℃诱导培养15-28小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤3)中表达所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白条件为TB培养基37℃培养3小时，加入终浓度为0.5mM IPTG，28℃诱导24小时。

6.根据权利要求1～5任一项所述方法制备的硫酸软骨素ABC酶融合蛋白。

7.一种DNA，所述DNA序列编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

8.一种重组载体，所述重组载体包括载体和权利要求7所述的DNA序列，其中，所述载体包括pMAL-c2x。

9.一种转化体，所述转化体是将权利要求8所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体，其中，所述宿主细胞包括E.coli Top10、JM109、BL21、BL21(DE3)和DH5α。

10.一种生产低分子量硫酸软骨素A，B或者C的方法，所述方法包括：

1)克隆并连接硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因，分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白基因，并连接上述基因，使得后续表达的3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接；

2)获得含有所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因的重组表达载体，将所述步骤1)连接的硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因重组到表达载体；

3)表达所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白，将所述步骤2)中克隆的含有硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因的表达载体转化到宿主细胞中，进行表达；

4)收获并纯化表达的所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白；以及

5)使用步骤4)所述纯化的硫酸软骨素ABC酶融合蛋白降解底物，反应温度为30-55℃，反应时间为5-10h，生产低分子量硫酸软骨素A，B或者C。